冯佑民(1936—)，河北省滦县人，1964年毕业于北京大学生物系生物化学专业，同年分配到中国科学院上海生物化学研究所。主要从事“结晶胰岛素全合成”的后继研究：胰岛素及相关蛋白质的结构功能、胰岛素受体、胰岛素及其类似物的基因表达、蛋白质工程以及单、双链胰岛素和相关蛋白质的体外折叠机制等。期间曾先后在美国Miami医学院、纽约MemorialSloan-Ketterring Cancer Center、美国哈佛大学医学院和法国巴黎十一大学居里研究所进修或合作研究。
冯佑民
在胰岛素合成中，在A链内和A、B链间的3对二硫键正确配对是合成成功的关键。结晶牛胰岛素合成成功之后，张友尚先生、朱尚权先生等人长期进行胰岛素结构功能研究，邹承鲁先生团队进行了蛋白质折叠研究，我们在酵母中成功表达了猪胰岛素前体(porcine insulin precursor, PIP) 的基因，并建立了胰岛素蛋白质工程技术。在这些研究基础上，我们于21世纪初，开展了单、双链胰岛素的体外折叠机制的研究。
鉴于胰岛素在体内以单一肽链被合成为胰岛素原(proinsulin) 并完成折叠，连接A、B链的肽段(C肽) 被切除，成为成熟的双链胰岛素，释放到血液中。故称前者为单链胰岛素，后者为双链胰岛素(胰岛素)。单、双链胰岛素各含3对相同的二硫键：A链内6位和11位间的1对二硫键A6-A11和A7-B7、A20-B19的2对A、B链间二硫键，它们的三维结构也相同。单、双链胰岛素体外折叠机制研究的主要内容为：捕捉折叠过程的中间体并对其分离纯化、结构分析，继而提出体外折叠途径。
1 单链胰岛素的体外折叠
我们首先研究了单链胰岛素——猪胰岛素原(PIP) 的体外折叠。将完全还原/变性的猪胰岛素前体加入到再折叠缓冲液中，于折叠过程中，捕捉到3个折叠中间体，经分离纯化、结构分析，其中1个中间体含1对二硫键，命名为1SSPIP，2个中间体含2对二硫键，命名为2SSPIP。
进一步分析证明1SSPIP含A链内二硫键[A6-A11]，虽然2个含2对二硫键的中间体2SSPIP 都含[A20-B19]二硫键，但是没有捕捉到含1对二硫键[A20-B19]的中间体1SSPIP。推测1SS [A20-B19]PIP可能是一个短暂的过渡态中间体。为此我们用蛋白质工程方法制备了具有[A20-B19]二硫键的模型肽[A20-B19]PIP，圆二色性光谱(CD) 等分析提示该中间体保留了部分折叠的构象，它在体外折叠中能迅速、高效形成具有[A20-B19] 二硫键的PIP，推测这对二硫键产生于PIP 折叠的早期阶段。我们继而研究了人胰岛素原(human proinsulin,HPI) 的体外折叠，捕捉到3个中间体，各含3对二硫键，除中间体P2含1对正确配对的二硫键SS[A20-B19] 外，其余全是非正确配对的二硫键。
此外，还研究了被认为是胰岛素祖先分子的文昌鱼类胰岛素肽(amphioxus insulin-like peptide, AILP)的体外折叠，捕捉到4个中间体，各个中间体的二硫键对数和配对。
基于对上述单链胰岛素在其体外折叠过程中，中间体的捕捉、分离纯化、结构分析，分别提出了PIP的体外折叠途径、HPI的体外折叠途径和AILP 的体外折叠途径。
上述单链胰岛素体外折叠的研究揭示了一些共同的折叠行为：首先，含[A20-B19]链间1对二硫键(1SS) 的中间体在体外折叠中非常重要，它形成于折叠的起始阶段(initial stage)，是1 个短暂的过渡态中间体。在猪胰岛素原PIP的折叠过程中，虽然没有捕捉到1SS[A20-B19]PIP，但是在捕捉到的2个2SSPIP中间体都含有二硫键[A20-B19] ；人胰岛素原HPI折叠中间体P2含有二硫键[A20-B19]；1SSAILP中间体的二硫键为[A20-B19]；用蛋白质工程制备的[A20-B19]猪胰岛素原PIP保留部分折叠构象，且能在体外有效折叠。其次, 第二个二硫键的形成是可变通的(flexible)，且可由非天然二硫键重排成天然二硫键。
2 双链胰岛素的体外折叠
在双链猪胰岛素的体外折叠过程中，捕捉到6个中间体：2个A链中间体：P1A和P3A，4个B链中间体P2B、P4B、P5B 和P6B，未捕捉到集聚的A链或B链以及双链中间体。
6个中间体分别与完全还原的A链或B链进行体外折叠，都能折叠成胰岛素。实验表明，中间体P1A和P5B是稳定的，而中间体P3A和P4B则很活泼，A链的2个中间体P1A和P3A是可以相互转换的；B链的4个中间体P2B、P4B、P5B和P6B也可以相互转换。这6个中间体产生于胰岛素体外折叠的早期阶段。
基于6个中间体都能最终折叠成胰岛素；1SSPIP是1个可捕捉到的含天然二硫键[A6-A11]的中间体；A链含4个半胱氨酸分别位于A6、A7、A11和A20，其中A6和A11形成A链内二硫键[A6-A11]，A7和A20分别与B链形成2个链间二硫键：[A7-B7]和[A20-B19]。中间体P3A含1个链内二硫键：[(A6，A7，A11)-A20]，是1个不稳定的非天然二硫键，在折叠中P3A是1个很活泼的中间体。因此我们认为在相继的折叠过程中，P3A通过半胱氨酸的-SH( 巯基)/ 二硫键交换形成更活泼的含天然二硫键[A6-A11]的过渡态中间体：([A6-A11]+A7-SH+A20-SH)A (T I)。中间体P4B的B7是半胱氨酸的-SH，P6B的B19是半胱氨酸的-SH，T I 一旦形成，它即与P4B和P6B识别并通过-SH/-SH之间的氧化作用，分别形成含2个天然二硫键的[A6-A11,A7-B8] 过渡态中间体(T II) 和[A6-A11,A20-B19] 过渡态中间体(T III)。过渡态中间体T I、T II、T III 存在非常短暂且非常活泼，尚未捕捉到。由此我们提出双链胰岛素体外折叠途径分为两步：(1) 在折叠的早期阶段，完全还原的胰岛素形成6 个中间体，且最终都能折叠成胰岛素；(2)在相继的折叠过程中，P3A通过半胱氨酸的-SH/二硫键交换形成过渡态中间体T I，T I 进一步通过与P4B或P6B识别和半胱氨酸-SH和-SH 之间的氧化作用形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体T II 和T III，T II 和T III 通过分子内的半胱氨酸的-SH/二硫键的交换反应迅速形成第3个二硫键，完成折叠。
以上表明双链胰岛素的体外折叠行为与单链胰岛素有很大差异，两者在一级结构上的区别为：前者是A、B链由2对链间二硫键相连，后者除2对链间二硫键外，还通过‘C 肽’连结A、B 链为单一肽链。单链胰岛素的C肽长短虽然不一，但都能在体外折叠成相同的3对二硫键和三维结构。在完全还原/变性的条件下，单链胰岛素的A、B链仍由C肽拉着，而双链胰岛素的A、B链则是断了线的风筝。故C肽的存在与否可能是导致单、双链胰岛素体外折叠行为差异的主要原因。
当时我们考虑到，双链胰岛素体外折叠机制的研究，是“结晶胰岛素全合成”的直接的后续工作，“结晶胰岛素全合成”发表在《中国科学》，故也将其发表在《中国科学》。我们的上述工作得到了国际同行的认可和重视，2006年应Antioxidannts &Redox Signaling (ARS) 杂志邀请于2008年在该杂志的10卷1期发表了“Forum Review: The in vitroOxidative Folding of the Insulin Superfamily”；2009年应《Folding of Disulfide Proteins》书的编者邀请承担了该书的一章，该书于2011年出版，其中第四章：In Vitro Folding of Single/Double Chain Insulinand Related Proteins 是我们写的；根据ResearchGate 报告，截至2015年5 月初，我们十多年前关于胰岛素方面的研究结果，仍然被科学家所关注，已有572次引用，1139次下载，4237次阅读和713次Profile views。我们也希望与《生命科学》的读者分享我们关于单、双链胰岛素的体外折叠的研究结果，以纪念“结晶胰岛素全合成”50 周年。
（本文原发表于《生命科学》2015年第27卷第6期）