李劲松研究组建立过滤富集单倍体胚胎干细胞的方法
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时间：2018-03-15
2月15日，国际学术期刊Journal of Biological Chemistry 在线发表了李劲松研究组题为Haploid embryonic stem cells can be enriched and maintained by simple filtration的文章。该文章建立了一种简单、可靠且有效的单倍体细胞富集方法。
多年来科学家对单倍体细胞的探索始终孜孜不倦。2011年，小鼠孤雌单倍体胚胎干细胞（parthenogenetic haploid embryonic stem cells, PG-haESCs）建立。2012年，小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞（androgenetic haploid embryonic stem cells, AG-haESCs）建立。随后，大鼠、猴子和人的haESCs也相继建立。单倍体细胞因其只含有一套染色体，不会遮盖隐性性状，在研究基因功能上可提供很大的帮助；它还具有干细胞的特性，能体外无限增殖且具有干性；同时小鼠的孤雄单倍体胚胎干细胞具有类精子的特性，主要表现在能使小鼠的卵母细胞受精并生出半克隆小鼠。将这些特性联合到一起，就小鼠的haESCs而言，不仅在细胞水平同时也在个体水平搭起了研究基因功能的桥梁。
然而，美中不足，haESCs自出生就伴随着不断自发二倍化的问题。自发二倍化也使得从ESCs建立之初，科学家就尝试建立haESCs但没有成功，直到流式分选技术（fluorescence activated cell sorter, FACS）被应用到单倍体的富集上。其原理是， Hoechst染色后，不同DNA含量的细胞在激光照射下会被区分开，通过给单倍体细胞加电使其发生偏转后收集下来，从而实现单倍体细胞富集。但是，Hoechst染料会一定程度影响DNA复制。 FACS富集回来的细胞第一代生长状态远不如正常传代的细胞。而且暂不论流式分选所需的设备及费用，整个过程中的激光照射，加电加压等可能给细胞带来额外潜在的基因突变。另外，该方法需要复杂、昂贵的仪器支持，富集成本高。
在此背景下，李劲松研究组根据单倍体细胞与二倍化了的细胞的平均直径的差异，通过过滤的方法在体外稳定地维持单倍体细胞单倍体性超过30代。该过滤系统由商业化的一片布满5μm或8μm小孔的滤膜与一个滤膜的支撑装置，外加一个注射器组成。成本很低且均可实现无菌操作。对细胞活性及单克隆形成能力的研究发现过滤第一代细胞远优于FACS富集的细胞。与此同时，过滤不同次数的AG-haESCs仍能正常支持半克隆小鼠的出生。并且，CRISPR/Cas9介导的基因敲除与敲入均可在过滤富集的细胞上正常实现，相应基因敲除的半克隆小鼠也正常出生。除此之外，该方法也可用于小鼠单倍体细胞的建立以及人的单倍体细胞的富集。过滤富集单倍体细胞的方法为单倍体细胞相关技术的发展、应用和推广提供了保障。
瞿超和晏萌为本文的共同第一作者，该研究得到清华大学陈晔光教授的帮助；工作得到了全基因组标签计划（Genome Tagging Project, GTP），以及国家科技部、国家基金委、中国科学院（细胞命运可塑性先导B）和上海市科委经费的支持；同时获生化与细胞所公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞生物学技术平台的大力支持。
