周斌研究组利用新创建的谱系示踪技术揭示发育过程中心脏瓣膜间充质细胞的起源及动态变化

        8月15日，国际学术期刊Development在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组的科研成果“Dual genetic tracing system identifies diverse and dynamic origins of cardiac valve mesenchyme”。该研究首次基于Nigri-nox同源重组构建转基因工具小鼠，并利用基于Nigri-nox和Cre-loxP系统构建了更为精准的双同源重组系统，具有能够在体内同时标记并示踪两群独立的干细胞群能力，并利用此新系统揭示了心脏瓣膜间充质细胞的起源及动态变化。Nigri-nox系统与传统的Cre-loxP系统相结合在体内的成功应用为发育、疾病和再生研究提供了更多的技术选择。

 

        基于位点特异性同源重组（SSR）系统的遗传谱系示踪技术被广泛用于器官发育、疾病及组织再生研究。目前，多种SSR系统被普遍使用，例如Cre-loxP、Flpe-frt和Dre-rox，使用最普遍的是Cre-loxP系统，当Cre被组织特异性基因的启动子驱动后，Cre表达并识别两个同向的loxP位点，将两个loxP位点之间的转录终止序列切除，从而使转录终止序列后的报告基因正常表达，由于这种切除位于基因组上，具有永久性和不可逆性，因此，所有表达过Cre的细胞群及其子代细胞（无论是否还在表达Cre）都将永久性地被报告基因蛋白所标记。基于这一特性，SSR系统被广泛用于细胞起源和命运研究，开发出新的SSR系统也会极大地拓宽谱系示踪技术的选择空间。

 

        但是生命体的发育过程及其复杂，不同组织的细胞起源及命运具有多向性和交叉性。虽然Cre-loxP系统已被普遍使用，然而Cre通常与传统的单一报告基因（例如Rosa26-LacZ、Rosa26-tdTomato、Rosa26-GFP）结合使用，Cre被启动子驱动后可使表达Cre的细胞表达一种相应的报告基因，即只能标记并示踪一种细胞类型，这对于生命体复杂的发育、疾病、再生研究是远远不够的。虽然前人基于不同的SSR系统已经开发了多种双系统（或多系统）致力于体内精确的谱系示踪研究（例如R26::FLAP, RC::Fela, R26NZG, RC::FrePe, RC::RLTG），这些系统可归为同一类型，即适用于标记示踪某干细胞群及其亚群这两种细胞类型，而并不具备标记两类独立的干细胞群能力。而开发出一种新的能够同时标记两群独立细胞群的谱系示踪技术对于发育和再生医学研究极其重要。

 

        为了填补这一技术空白，并开发新的可以应用于体内基因编辑的SSR系统。周斌研究组的科研人员基于Nigri-nox同源重组系统构建了世界上第一只体内受Nigri-nox系统调控的转基因工具小鼠——Cdh5-Nigri小鼠；并将Nigri-nox系统与传统的Cre-loxP系统结合起来，开发了一种可用于体内同时标记示踪两群独立细胞群的新的谱系示踪系统，称之为R26-NLR（Rosa26-nox-loxP-reporter）。R26-NLR报告基因小鼠上包含两个nox位点和两个loxP位点以交错形式存在（nox-loxP-Stop-nox-ZsGreen-polyA-loxP-tdToamto）, Cre同源重组酶介导loxP重组使报告基因tdTomato表达，Nigri同源重组酶介导的nox重组使报告基因ZsGreen表达，当Cre和Nigri同时被两种独立的细胞特异性启动子驱动后，可实现在体内同时标记并示踪这两群独立的干细胞类群。标记何种细胞类群完全取决于Cre和Nigri序列之前的启动子，脱离了前人开发的双系统技术的限制。

 

        为了进一步展示R26-NLR新系统的优势，研究人员利用这一系统探究了在小鼠心脏发育过程中瓣膜间充质细胞的起源及动态变化。哺乳动物心脏包括四组瓣膜，包括两组房室瓣膜（二尖瓣和三尖瓣），两组半月瓣（主动脉瓣和肺动脉瓣）。前人的研究证明房室瓣膜间充质细胞主要来源于心脏心内膜和心脏心外膜，而半月瓣间充质细胞主要来源于心脏心内膜和神经嵴细胞。为了更方便地在同一个体观察相应的两群干细胞群对瓣膜发育贡献的动态变化。研究人员将R26-NLR系统与Tbx18-Cre小鼠（标记心脏心外膜）和Cdh5-Nigri小鼠（标记心脏心内膜）交配得到能够同时标记心脏心外膜和心脏心内膜的Tbx18-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，通过对小鼠发育各个时间点的取样分析，发现这两群干细胞对房室瓣膜的贡献是动态变化的，E14.5之前，二尖瓣和三尖瓣的腔壁侧瓣膜（与心室壁相接触）间充质细胞主要来源于心内膜，E14.5天之后，随着瓣膜发育，自瓣膜近端到远端逐渐被心外膜分化来源（EPDCs）的间充质细胞所替代，这种细胞更替现象能够一直持续到出生后P7天左右，而二尖瓣和三尖瓣的室间隔瓣膜（与室间隔相接触）间充质细胞从瓣膜开始形成到出生后基本都来源于心脏心内膜。同时，研究人员还获得了Wnt1-Cre;Cdh5-Nigri;R26-NLR三基因型小鼠，在体内同时标记示踪神经嵴细胞（Wnt1-Cre）和心内膜细胞，通过对小鼠发育各个时间点取样分析，发现半月瓣发育中间充质细胞来源的动态变化与房室瓣不同，在发育早期（E13.5左右），主动脉瓣膜间充质主要起源于神经嵴细胞，随着瓣膜发育直到小鼠出生后，神经嵴细胞来源的比例降低，心内膜来源的比例升高，但是并不会被全部替换掉，最终保持3:2左右比例，而肺动脉瓣发育中没有观察到类似的动态变化，基本一直保持3:1左右比例。R26-NLR系统在体内研究的成功应用展现了其在解决多细胞起源科学问题中的应用前景，而且也为更加准确的谱系示踪技术提供了可靠的技术思路。

 

        该研究工作在周斌研究员的指导下，由研究生刘扩等完成，得到了香港中文大学吕爱兰教授、美国加州大学Sylvia Evans教授等的大力支持，同时得到中国科学院、国家基金委、国家科技部、上海市科委等经费资助。

 

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