李劲松研究组合作实现基于核移植技术的人类精子的体外扩增

       12月19日，国际学术期刊Cell Research在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李劲松研究组和山东大学医学院陈子江研究组、北京大学未来基因诊断高精尖创新中心汤富酬研究组共同合作实现基于核移植技术体外扩增人类精子的研究：“In vitro expansion of human sperm through nuclear transfer”。

 

        该研究通过优化的胚胎构建策略和单倍体胚胎干细胞低氧建系策略首次建立了人类精子来源的孤雄单倍体胚胎干细胞系（AG-haESCs），证明了人类精子可以被重编程为孤雄单倍体胚胎干细胞，并发现人孤雄单倍体胚胎干细胞系（hAG-haESC）可以稳定维持父源印记基因的特异性甲基化修饰模式，可以在增殖和分化过程中保持单倍体倍性的稳定，因而可以作为父源遗传物质的替代物用于研究人类着床前胚胎发育的调控机制。

 

        二倍体核型是哺乳动物细胞的主要核型，单倍体细胞仅存在于雌雄生殖细胞发生的特定阶段，而单倍体的生殖细胞由于处在终末分化状态无法在体外实现增殖。2011年剑桥大学(Leeb and Wutz,2011,Nature)和奥地利科学院(Elling et al.,2011,Cell Stem Cell)首次报道利用卵子孤雌激活结合流式分选技术（FACS）建立了哺乳动物（小鼠）孤雌单倍体胚胎干细胞系。2012年中科院生化所李劲松课题组(Yang et al.,2012,Cell)和动物所周琪课题组(Li et al.,2012,Nature)首次报道建立了小鼠精子来源的AG-haESCs，并发现此类细胞可以支持产生半克隆小鼠，同时定义AG-haESCs为“人造精子细胞”。“人造精子细胞”只具有一套遗传物质，结合CRISPR/Cas9基因编辑工具可以在细胞水平和个体水平进行复杂基因编辑和大规模的基因筛选。此后科学家继续尝试建立灵长类动物的单倍体胚胎干细胞，2013年李劲松研究组首次报道建立非人灵长类动物食蟹猴的孤雌单倍体胚胎干细胞系(Yang et al.,2013,Cell Res)。2016年美国哥伦比亚大学团队(Sagi et al.,2016,Nature)和李劲松团队(Zhong et al.,2016,Cell Res)先后报道建立了人类卵子来源的孤雌单倍体胚胎干细胞系。国内外相关研究团队长期致力于建立灵长类动物精子来源的孤雄单倍体胚胎干细胞，但是均未取得成功，而灵长类动物包括人类的精子能否被重编程为孤雄单倍体胚胎干细胞也是长期存在的疑问。

        

        为了验证人类精子能否被重编程为人类胚胎干细胞， 研究团队采用了细胞骨架非破坏性的核移植策略构建了人孤雄胚胎，即受精后通过预激活然后去除第二极体（PB2）和前原核（PPN）的方式去除母源遗传物质（图1）。经过传统的胚胎干细胞系（正常氧环境21% O₂）建系，发现得到的细胞系全部为二倍体（5/5）。而此前有研究报道低氧培养环境有利于人胚胎干细胞的干性维持和小鼠EpiLC（小鼠表胚层样细胞）的建立，并且研究团队发现5% O₂有助于单倍体干细胞单倍体的维持。基于此，团队推测低氧环境可能有利于人孤雄单倍体胚胎干细胞系的建立，并利用新的建系环境成功建立了两株hAG-haESCs，发现在培养过程和体内体外分化过程中hAG-haESCs的单倍体倍性均保持相对稳定。

 

        同时，研究团队通过全基因组DNA甲基化测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）揭示了hAG-haESCs具有与精子类似的印记基因修饰模式和表达模式，尤其是在对于胚胎发育至关重要的H19-DMR和IG-DMR上保持了严格的父源印记修饰特征（图2），而这一特征在此前建立的小鼠“人造精子细胞”中是不存在的，这暗示了hAG-haESCs支持胚胎发育的能力。进一步，研究人员利用hAG-haESCs代替精子对卵子进行“授精”，结果发现重构的胚胎可以成功发育到囊胚并可建立胚胎干细胞系。结合单细胞转录组测序技术（single-cell RNA-seq）揭示了hAG-haESCs来源的胚胎和精子受精来源的胚胎高度相似（图3）。这项研究论证了人类精子可以重编程为单倍体胚胎干细胞，为将来的生命科学和生殖医学研究提供了前瞻性的技术储备。

 

       分子细胞中心博士生张晓宇、北京大学未来基因诊断高精尖创新中心博士生郑宇轩、山东大学医学院教授吴克良和教授赵涵为共同第一作者，分子细胞中心李劲松研究员、山东大学陈子江院士、北京大学未来基因诊断高精尖创新中心汤富酬教授为共同通讯作者。该研究得到分子细胞中心细胞分析技术平台和基因组标签计划研发中心的大力支持，同时该研究还得到国家自然科学基金委、国家科技部和中国科学院以及上海市的经费资助。

 

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