2月4日，国际学术期刊Circulation Research 以封面文章发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究组和海南大学骆清铭研究组题为“Extension of Endocardium-derived Vessels Generate Coronary Arteries in Neonates” 的最新研究成果。在该研究中，他们发现了新生期小鼠冠状动脉生成的新方式，心内膜来源的管状结构通过向外扩张、动脉化等一系列过程生成横跨心脏内外侧壁的心肌层冠状动脉，而这一过程受到Mettl3和Notch信号通路的调控。生成的冠状动脉可以持续到成年，在心脏损伤如心肌梗死中发挥重要的保护作用。该研究利用多种单/双同源重组酶介导的谱系示踪技术，并结合荧光显微光学切片断层成像fMOST技术，清晰地展示了新生期小鼠心脏中冠状动脉生成新方式，为损伤心脏的血管修复和治疗提供新的研究方向，也为心血管再生医学提供了新思路。
冠状动脉疾病发病率近年来一直呈上升态势，如今已经成为人类健康的头号杀手。冠状动脉疾病患者大多数丧失劳动力，其中心肌梗死的致残率达到50%，严重危害人民的生命和健康。冠状动脉可以向心脏供给氧气和营养物质，从而维持心脏正常的生理功能。然而，当冠状动脉发生病变，如血管壁发生动脉粥样硬化，管腔迅速发生持久而完全的闭塞，导致冠状动脉供血急剧减少或者中断，使相应的心肌持久而严重地急性缺血，从而引发心肌梗死。关于冠状动脉疾病引起心肌梗死和心衰的研究很多，如何提高损伤心脏的供血机能已是该领域的研究热点。因此，揭示冠状动脉的生成方式，阐明冠状动脉形成的分子机制，将有助于人们进一步了解冠状动脉疾病，并为心脏损伤后血管新生治疗提供新的策略或方法。
目前认为，发育过程中心脏的冠状动脉内皮细胞主要来源于静脉窦和心内膜。由静脉窦来源的冠状血管，定义为第一群冠状血管群（1st CVP），主要分布在心脏的外侧心肌壁。而心内膜来源的血管（2nd CVP）主要分布在心脏的内侧心肌壁以及室间隔。这些不同来源的血管内皮细胞经过增殖、分化及重塑等过程形成冠状血管丛。目前观点认为，冠状动脉主要由第一群冠状血管内皮迁移、聚集、合并及动脉化形成，新生期心脏的冠状动脉形成是否有其他新的生成方式仍需进一步研究。为了系统地研究新生期心脏中冠状动脉血管发育过程和生成方式，研究者首先利用Tie2 Cre;CX40-LSL-GFP双谱系示踪系统，结合组织透明化及光片荧光显微成像处理，清晰地解析了冠状动脉在新生期小鼠心脏中的发育过程。研究者发现，新生小鼠心脏中的心肌层中的冠状动脉数量会随着心脏的发育而增多，随着时间的推移，比较出生后3天和出生后7天的小鼠心脏，会发现这一过程中心脏内侧壁的冠状动脉明显增多，那这些冠状动脉来源于哪里呢？这为研究者进一步的研究提供了方向。
前期相关研究认为，冠状动脉主要由分散的内皮细胞通过血管新生、迁移、聚集、重塑形成。在胚胎期，1st CVP的内皮细胞可以通过迁移、融合、分化为冠状动脉。为了标记这一群来源的冠状血管，研究者构建了Apln-CreER小鼠，通过谱系示踪发现1st CVP冠状动脉主要分布在心脏外侧壁心肌层中，并在出生后一周随着心脏发育进一步扩张。通过免疫荧光染色发现，在出生后7天的心脏中，1st CVP和2nd CVP的血管内皮细胞分别位于心脏心室壁外侧和内侧。但发现在1st CVP区域出现了一些未被Apln标记的冠状动脉，而这些未被Apln标记的冠状动脉持续到成体小鼠心脏。利用Apj CreER谱系示踪小鼠，研究人员发现了同样的情况。这群存在于心脏1stCVP区域内但未被Apln/Apj-Cre标记的冠状动脉来源于哪里呢？为了研究这一群冠状动脉来源，研究者利用心内膜特异性的Npr3-CreER小鼠进行谱系示踪，检测心内膜是否贡献到这一群特殊的冠状动脉内皮细胞。他莫昔芬诱导处理怀孕13.5天的小鼠，收集出生后0天到28天的小鼠心脏样本，对出生后3天和 5天的样本进行检测，发现在心脏1st CVP 区域存在心内膜来源的管道或索道状结构，经过染色发现，这一群细胞既不表达成熟血管标记FABP4和Pdgfb，也没有招募血管平滑肌细胞，因此并不是冠状动脉。而检测出生后7天、14天、28天以及成体小鼠心脏样本，可以发现在1st CVP 区域存在心内膜来源的冠状动脉。研究者将出现在出生后3天和5天的这一特殊结构称为“前体冠状动脉索道”。研究者进一步发现，前体冠状动脉索道相较于周边的血管内皮，具有更高的细胞外基质基因和动脉形态发生的相关基因的表达，而且出生后5天以后才能够具有成熟的血管功能，能够完全连接到循环系统。综上，研究者确定了1st CVP 区域存在心内膜来源的冠状动脉，而这一动脉是由心内膜来源的前体冠状动脉索道向外延伸生成的。为了进一步证明这一结论，研究者将谱系示踪技术和透明化技术相结合，收集他莫昔芬诱导处理的Npr3-CreER小鼠心脏，在整体心脏中清晰地观察到前体冠状动脉索道在出生后五天的小鼠心脏外侧肌肉层出现，更多的被标记的冠状动脉出现在出生后7天以及28天。综上，心内膜形成了1st CVP 区域早期的前体冠状动脉索道，随着心脏的发育过程，前体冠状动脉索道通过随后的动脉化形成成熟的冠状动脉，将1st CVP和2nd CVP两个不同起源的冠状血管群有效连接在一起。
为了进一步阐明这种由心内膜来源内皮细胞向外侧心肌层迁移并形成的冠状动脉过程，研究者采用了荧光显微光学切片断层成像（fMOST）方法，对动脉形成过程进行了更为精细的完整心脏单细胞水平的成像。研究者将样本处理成1.0 μm厚度，然后用水镜进行成像。依据不同心脏大小，整个数据持续21-74小时，覆盖整个心脏的1700-5500张冠状面。数据经过一系列的处理重建，发现出生后5天的小鼠心脏心室壁外侧中出现前体冠状动脉索道，而出生7天后的心脏心室壁外侧中出现成熟的冠状动脉血管。研究者利用亚微米分辨率（0.320.321μm3）进行三维重建心脏的横向视图，可以清晰地看到形成冠状动脉的前体冠状动脉索道。为了进一步确认生成的是一群具有功能的成熟冠状动脉，研究者收集Npr3-CreER;R26-tdTomato;Cx40-GFP 心脏，通过fMOST成像可以清晰地看到前体冠状动脉索道生成的冠状动脉能连接1st 和 2nd CVPs，共同形成心脏的循环系统。
在分子机制方面，研究者通过一系列组织特异性基因敲除的遗传学方法，阐明了Mettl3和Notch信号通路可以调节前体冠状动脉索道的形成，从而调控着发育心脏中这一群特殊的冠状动脉数量。心内膜特异性Mettl3敲除后，心脏出现了更多的冠状动脉；而在Mettl3敲除基础上再敲除Notch信号通路Dll4或者Rbpj基因，心脏的冠状动脉形成明显减少，提示Mettl3-Notch信号通路调控心内膜来源的冠状动脉生产。进一步功能研究，研究者检测了这一群冠状动脉的心脏损伤修复中是否有作用，利用结扎冠状动脉左前降支构建了心肌梗死模型，发现心内膜来源的前体冠状索道生成的冠状动脉数量的增加和减少都会影响着心肌梗死后心脏功能的改变。综上，研究者发现心内膜来源的前体冠状索道结构，可以经过动脉化后形成具有功能的冠状动脉，这一群冠状动脉连接出生后心脏的两个冠状血管群，而这一过程收到Mettl3和Nocth 信号通路的精细调控，同时这一群冠状动脉对成体心脏损伤后心脏功能的维持起着重要作用。
分子细胞卓越中心唐娟博士（现同济大学研究员）、博士生朱欢以及田雪莹博士（现暨南大学研究员）为该论文共同第一作者。分子细胞卓越中心周斌研究员和海南大学骆清铭教授为该论文共同通讯作者。华中科技大学龚辉教授、牛津大学Nicola Smart教授、复旦大学附属中山医院颜彦教授、分子细胞卓越中心童明汉研究员、西湖大学何灵娟研究员等也为该项研究提供了支持和帮助。该研究得到分子细胞卓越中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和国家蛋白质科学研究（上海）设施的大力支持。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委等经费支持。
文章链接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCRESAHA.121.320335
Circulation Research封面：新生期第7天Tie2-Cre;Cx40-LSL-GFP转基因小鼠的心脏荧光图片，其中绿色荧光信号代表冠状动脉内皮细胞。
