6月12日，国际学术期刊《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)在线发表了国科大杭州高等研究院生命与健康学院/中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究组与复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室陆路课题组合作研究成果“An inducible hACE2 transgenic mouse model recapitulates SARS-CoV-2 infection and pathogenesis in vivo”。该研究利用Cre-loxP遗传谱系示踪技术与人源化hACE2结合，创建了一种诱导型hACE2小鼠模型，结合细胞特异性Cre工具小鼠可实现在靶细胞中特异性表达hACE2蛋白并同时对靶细胞进行遗传示踪。此诱导型hACE2小鼠模型不仅适用于对SARS-CoV-2药物筛选和疫苗评价，还可应用于SARS-CoV-2感染相关的细胞机制和遗传学研究。
新型冠状病毒感染(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道传染病。尽管目前全世界已经步入后疫情时代，但疫情并未完全消失，依然会出现小规模传播或波浪式流行态势，其重症患者易出现一系列严重的并发症，威胁患者生命健康。病毒变异具有随机性，因此构建适用于SARS-CoV-2等可利用ACE2受体感染的各类冠状病毒(包括SARS-CoV及SARS相关冠状病毒、HCoV-NL63等)研究的小鼠模型对于研究SARS-CoV-2等致病机理并测试新型治疗方案，应对将来未知风险具有重要意义。
SARS-CoV-2可通过识别人体细胞表面的血管紧张素转换酶2(hACE2)进入人体细胞。人体中多种组织脏器表达hACE2，例如上呼吸道、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、肠道和大脑等等，因此这些器官都会被SARS-CoV-2识别并攻击。肺部是SARS-CoV-2攻击的首要目标。人类肺脏中多种上皮细胞类型表达hACE2，包括I型肺泡上皮细胞(AT1细胞)、II肺泡上皮细胞(AT2细胞)、分泌细胞(club细胞)、基底细胞(basal细胞)和纤毛细胞(ciliated细胞)等。其中AT2细胞负责肺泡上皮受损后的再生修复，人体AT2细胞高表达hACE2，是SARS-CoV-2在肺部的重要攻击对象之一。
人源化小鼠是研究人类疾病的重要模型，研究发现小鼠细胞血管紧张素转换酶2(mACE2)不易于被SARS-CoV-2识别，因此构建的人源化hACE2新冠小鼠感染模型被广泛应用于新冠病毒感染相关研究。目前已报道多种人源化hACE2转基因模型小鼠，这些hACE2的表达受Krt8，HFH4，CAG或mACE2启动子驱动。然而Krt8在肺脏主要表达在支气管管腔上皮细胞，HFH4主要表达在支气管ciliated细胞，CAG为广谱型启动子在所有细胞类型表达。在本研究中，研究人员构建了mACE2-2A-CreER;R26-tdTomato工具小鼠并揭示在小鼠肺脏中mACE2主要表达在支气管club细胞中。因此，基于上述启动子构建的hACE2转基因工具均无法完全模拟人体内hACE2的表达谱，特别是对AT2细胞的靶向。为了解决这一问题，研究人员将CAG-loxp-stop-loxp-hACE2-IRES-tdTomato序列插入到Rosa26基因位点，构建了一种可诱导型hACE2转基因模型小鼠，简称为R26-hACE2-tdT。R26-hACE2-tdT的工作原理为，当发生Cre-loxP重组，Cre+细胞会同时表达hACE2和tdTomato蛋白，由于这种同源重组发生在DNA水平，所以Cre+细胞及其所有子代细胞均会永久性表达hACE2并被标记为tdTomato。针对以上提到的已有hACE2工具细胞靶向的不足，R26-hACE2-tdT可以结合细胞特异性表达Cre的工具小鼠，实现细胞特异性及高效性靶向标记，以精确模拟和应用于SARS-CoV-2攻击人体细胞的病理研究。
为了验证R26-hACE2-tdT小鼠模型，研究人员以AT2细胞，club细胞和ciliated细胞为例，分别构建了AT2-hACE2、Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型小鼠进行SARS-CoV-2感染验证。因为AT2细胞是已有hACE2模型小鼠首要遗漏标记靶细胞，所以研究人员首先结合AT2细胞特异性工具小鼠Sftpc-CreER构建了AT2细胞特异性表达hACE2小鼠模型：AT2-hACE2(Sftpc-CreER;R26-hACE2-tdT)。对AT2-hACE2小鼠模型进行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收样检测，发现肺部AT2细胞可被SARS-CoV-2特异性靶向，病理切片染色显示4 dpi肺部出现多种病理表型，并与新冠患者病理特征类似，包括肺泡壁增厚、纤维化沉积、免疫细胞浸润及血细胞渗漏等。这些病理特征在14 dpi得到明显缓解，并且小鼠肺部病毒载量随着时间推移呈现下降趋势，说明SARS-CoV-2感染后致病进程会有一个从严重到缓解的过程，这也与多数新冠患者的病情进展一致，随着时间推移肺炎会缓慢自愈。
为了验证新冠病毒感染工具小鼠对靶细胞的可选择性，研究人员又结合club细胞特异性工具小鼠Scgb1a1-CreER及ciliated细胞特异性工具小鼠Foxj1-CreER分别构建了Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型，进行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收样检测。同样的，研究人员检测到了与新冠患者肺部相似的病理特征，包括肺部纤维化、免疫细胞浸润及血细胞渗漏等。随着时间推移，肺部病理特征也具有从严重到缓解的过程。与AT2-hACE2模型不同的是，Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型感染后病理损伤会在支气管周围有积聚趋势，说明不同细胞类型感染后或不同区域感染后引起的病理表型具有差异性。然而新冠病毒感染者肺部炎症发展是多种细胞被感染后的综合性表现，其中每种类型细胞对感染的响应是否具有差异，是否可以针对这种差异开展细胞靶向治疗是未来需要探究的问题之一。综上，本研究基于Cre-loxP技术成功构建了可诱导型人源化hACE2小鼠模型，可搭配细胞特异性Cre遗传工具，不仅适用于对靶细胞特异性SARS-CoV-2感染研究、药物筛选、疫苗评价，还可应用于感染后组织再生修复的遗传学等研究。
国科大杭州高等研究院周斌课题组副研究员刘扩、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心博士研究生唐慕雪、复旦大学青年副研究员徐巍为该论文共同第一作者。杭州高等研究院生命与健康学院/中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究员和复旦大学医学分子病毒学教育部/卫健委/医科院重点实验室陆路研究员为该论文共同通讯作者。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委、杭高院等经费支持。
文章链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2207210120
图注：诱导型hACE2转基因小鼠模型的构建及应用策略
(A)R26-hACE2-tdT构建策略。(B，C)结合细胞特异性Cre工具，可实现在靶细胞中特异性表达hACE2并被永久性遗传标记。
