5月22日, 国际学术期刊Nature Communications在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)李劲松研究组与吴立刚研究组、徐国良研究组和北京大学汤富酬研究组的合作论文“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”。该研究建立了一种小鼠受精卵中基于高效胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor, CBE)的多基因同时敲除系统(inactivation of multiple genes in zygotes, IMGZ)，并通过利用IMGZ系统构建Tet/Dnmt家族基因多种组合敲除的胚胎，探讨早期胚胎发育中甲基化和去甲基化的作用，发现DNMT家族蛋白介导的DNA甲基化在小鼠原肠运动中发挥着重要作用，且不依赖于TET蛋白介导的DNA去甲基化的功能;进一步揭示Dnmt缺失胚胎中部分miRNAs启动子区域甲基化的完全缺失导致miRNAs的表达剂量上调，部分参与导致了小鼠原肠运动的失败。
在小鼠早期胚胎的发育过程中，DNA甲基转移酶蛋白DNMT1/3A/3B和双加氧酶家族蛋白TET1/2/3，动态调控DNA胞嘧啶的第五个碳原子上的甲基化(5mC)。受精后，精子和卵子中携带的配子源的5mC，会通过DNA复制介导的被动去甲基化和TET蛋白介导的主动去甲基化而逐渐被擦除，直到囊胚阶段达到最低点。着床后，在DNMT3A和DNMT3B介导的重头甲基化的作用下，胚胎在原肠运动时期DNA甲基化达到成年的水平，而后DNMT1维持DNA甲基化的功能使其在细胞分裂的过程中，维持着高度DNA甲基化的状态。已有研究表明，配子源敲除TET家族蛋白(TET1/2/3)会导致小鼠原肠运动发生失败;而携带Dnmt1或Dnmt3a/3b突变体的小鼠胚胎，在发育中期(E9.5)会发生胚胎致死现象。然而，尽管已经产生了缺乏DNA甲基化(Dnmt-null)的小鼠胚胎干细胞和滋养层干细胞系，并且它们展示出正常的自我更新的能力，但是DNA甲基化完全缺失的胚胎一直没有被构建，导致其在早期胚胎发育的功能和机制一直未被阐释。
为了克服生殖细胞中条件性敲除多个基因的多重困难，李劲松组建立了合子时期多个基因同时高效敲除的IMGZ系统。他们前期研究成果发现，胞嘧啶碱基编辑器(CBE)在小鼠受精卵中只需改变单个或两个碱基，可以特异地实现基因的密码子由CAA, CAG, CGA或TGG突变成终止密码子TAA, TAG, TGA或TAA，且对基因组的完整性产生较小的影响。为了实现在合子胚胎中高效的双等位基因突变，他们在受精卵中比较了6个已报道的CBE系统(BE3, Gam-BE4, hA3A-BE3-Y130F, hA3A-eBE3-Y130F, X-BE3 和 X-BE4)靶向EGFP和Crygc基因后产生终止密码子的能力，发现hA3A-eBE3-Y130F可以非常高效地产生单个基因的纯合敲除胚胎(>90%)，且在胚胎中只产生了一些低频的随机的SNVs脱靶现象。由于sgRNA的序列和靶向位置，会影响CBE最终的编辑效率，因此选择高效的sgRNA将会极大促进获得多基因纯合敲除胚胎的概率。因此，研究人员开发了一个快速设计适合CBE系统的sgRNA的网站(Base-Editor，https://github.com/DiabloRex/BASE-Editor)，根据预测选择靶向单个基因的多条高效的候选sgRNAs。他们首先针对Tet1，Tet2和Tet3基因，分别设计了3条符合条件会导致TET功能缺失的候选sgRNAs，并通过胚胎中效率测定，确定一条几乎会100%产生纯合敲除胚胎的sgRNA，进一步将靶向Tet1/2/3的3条sgRNAs和CBE的mRNA同时注射，高效地一步获取了Tet-TKO的胚胎。表型分析发现，合子期敲除TET家族蛋白的胚胎，可以进行原肠运动，在发育中期(E10.5)发生胚胎致死现象。这一结果显示卵母细胞中存在的TET蛋白对于原肠运动至关重要。
进一步，研究人员利用IMGZ系统获得了Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎，表型分析发现，Dnmt-null的胚胎在原肠运动时期形态明显异常，未形成完整的原条结构，且无法分化形成大脑、心脏和体节等原肠运动后期结构。而Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎却能正常进行原肠运动，形成可识别的脑、心脏和体节等结构，暗示DNMT1和DNMT3A/3B存在一套共同的机制用于维持DNA甲基化，就可以实现小鼠原肠运动的发生。RNA-seq结果也显示Dnmt-null的胚胎相比Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎，出现较多的发育和原肠运动相关通路基因的下调，而正常DNA甲基化的缺失应该会导致基因的上调，暗示其中可能具有其他的调控因素。为了探究TET蛋白介导DNA去甲基化在DNMT介导的DNA甲基化调控胚胎发育过程的作用，研究人员进一步构建了Tet/Dnmt1-4KO，Tet/Dnmt3a/3b-5KO和Tet/Dnmt-6KO的胚胎，但是它们发育的形态，基因组甲基化的程度和分布模式，与没有Tet敲除时的Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎基本一致，说明DNMT蛋白对胚胎发育的调控是不依赖于TET家族蛋白的。
为了探究Dnmt-null影响胚胎原肠运动发生的分子机制，研究人员收集不同突变体胚胎E6.5和E7.5的胚外(extraembryonic ectoderm, Exe)和上胚层(epiblast, Epi)组织分别进行全基因组甲基化和转录组测序。比较分析显示Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO胚胎相比于Dnmt-null胚胎中共同保留的高甲基化位点遍布基因组上的所有位置，包括retrotransposon，enhancer和promoter区域，且Epi中的位点数目明显高于Exe。通过分析这些在retrotransposon和enhancer的高甲基化区域对下游基因转录的影响，发现在Dnmt-null的胚胎相关基因的表达并未受这些区域甲基化的丢失而产生严重的影响。进一步，他们分析保留的高甲基化启动子区域对于基因表达的影响，发现相关编码基因基本也不受甲基化的完全丢失而变化，而其中大量的miRNAs启动子区域的高甲基化引起了研究人员的关注。
随后，研究人员利用微量小RNA测序系统(Cas9-assisted small RNA-sequencing, CAS-seq)，对这些胚胎中的miRNAs的表达丰度进行了定量研究，发现具有高甲基化启动子的miRNAs，几乎在Dnmt-null的胚胎中都出现了上调，而Dnmt-null胚胎中下调表达的基因也大多属于这些上调的miRNAs预测的靶基因。有趣的是，这些上调的miRNAs绝大部分都位于一个重要的印记调控区域Dlk1-Dio3，因此，研究人员首先证明了Dlk1-Dio3的差异甲基化区域(IG-DMR)和启动子区域的甲基化都会对这些miRNAs的表达产生影响。进一步，他们在小鼠类精子胚胎干细胞中将这个IG-DMR区域删除模拟它的甲基化状态，同时敲除了6个Dnmt-null胚胎中上调的miRNAs(let-7b, miR-127, miR-541, miR-369, miR-540, miR-409)。将这种改造的类精子胚胎干细胞注入小鼠MII卵子后，再敲除Dnmt家族基因，发现获得的Dnmt-null胚胎在E7.5的原条发育可以实现部分回补，暗示这些上调的miRNAs在抑制Dnmt-null胚胎发生原肠运动中发挥着重要的作用。然而这些胚胎仍然未能完成原肠运动，说明在甲基化完全缺失的胚胎中，依然存在着其它未知的因素影响原肠运动的发生，这将有待进一步更加细致地分析研究。
综上，该研究建立了体内多基因同时敲除的IMGZ系统，探究了DNMT和TET家族蛋白在小鼠胚胎发育过程中的功能关系，发现DNMT在调控小鼠胚胎发育过程中是不依赖于TET家族蛋白的;首次发现Dnmt-null的胚胎会导致小鼠原肠运动发生的失败，且发现甲基化调控的一些miRNAs的表达剂量，对于胚胎原肠运动的发生发挥着重要的调节作用。这些研究加深了DNA甲基化对于胚胎发育调控的理解，同时将为探究冗余基因在胚胎发育过程中的功能机制提供了重要的研究系统和范例。
分子细胞科学卓越创新中心副研究员李庆、博士研究生印熙娣、常允建、博士后王超，北京大学博士研究生卢健森和杭州高等研究院博士后晏萌为该论文的共同第一作者。分子细胞卓越中心李劲松研究员、吴立刚研究员、徐国良研究员和北京大学汤富酬教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委和博士后基金会等部门的经费资助。李庆博士感谢赛诺菲优秀青年人才奖励基金的资助。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-38528-z
IMGZ系统介导的Tet和Dnmt家族基因多种组合敲除胚胎的表型
