北京时间5月20日，国际学术期刊Cell Stem Cell在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）惠利健研究组联合仁济医院夏强院士团队、华东师范大学李大力研究员团队和上海科技大学iHuman研究所钟桂生研究员团队的最新合作研究成果：“Efficient expansion and CRISPR-Cas9-mediated gene correction of patient-derived hepatocytes for treatment of inherited liver diseases”。该项研究在前期工作的基础上建立了高效的肝脏遗传代谢性病人来源的肝细胞体外培养系统，并且实现了多种病人来源肝细胞的体外长期大量扩增。在此基础上，研究人员优化和建立了CRISPR-Cas9介导的基因敲入技术，实现了在遗传代谢性疾病病人来源的增殖肝细胞中高效定点纠正病人缺陷基因。此外，基因编辑的增殖肝细胞移植可以高效整合、再殖小鼠肝脏，并成功治疗了酪氨酸血症小鼠模型，证明体外基因纠正的增殖肝细胞治疗的有效性。综上，该研究建立了一套高效的肝脏遗传代谢性疾病病人来源肝细胞的体外培养和基因编辑技术，为人类肝脏遗传代谢性疾病的自体肝细胞治疗提供了概念上的验证。
肝脏作为人体新陈代谢的中心器官，其中肝细胞是肝脏功能最主要的承担者。肝细胞中一些关键功能基因的突变会导致危及生命的肝脏遗传代谢性疾病的发生，这类疾病的致病基因较多并且病情严重，目前除肝移植外尚无有效的治疗方式。然而，肝细胞在移植后具有很强的肝脏再殖能力，一些患有肝脏遗传性疾病的动物模型通过肝细胞移植后得到了有效的治愈。因此，肝细胞移植（Hepatocyte Transplantation, HTx）作为一种替代肝器官移植治疗肝脏遗传代谢性疾病的治疗方式具有广阔的应用前景。但是前期大量基础和临床研究结果表明，异体肝细胞治疗的长期有效性受限于移植后细胞的免疫排斥。所以，有效避免移植后细胞的免疫清除是实现病人肝细胞治疗成功的核心难题。
惠利健团队长期致力于研究开发新型肝细胞来源和终末期肝脏疾病治疗的相关研究。2018年，该团队建立了人原代肝细胞（Primary Human Hepatocyte, PHH）大规模扩增体系，在体外将PHH去分化为可增殖的人肝细胞(Proliferating Human Hepatocytes, ProliHHs)，该细胞介于肝细胞和前体细胞的双表型状态，能够在体外培养扩增超过10000倍，满足临床肝细胞移植所需细胞量。将该细胞移植到肝脏酪氨酸血症模型Fah-/-Rag2-/-IL2rg-/-（FRG）小鼠时，扩增的ProliHHs重建肝实质的效果能达到非常高的水平，这使其成为极有前景的细胞来源用于肝细胞治疗。2024年3月，该团队实现了大规模制备海藻酸钠微胶囊包裹的ProliHHs类器官，并用于肝衰竭治疗，为正在进行的临床研究奠定了坚实的基础。
为了探究肝脏遗传性疾病患者来源肝细胞的体外扩增及基因修复后的回输治疗，研究人员首先着手于分离和培养这些肝脏遗传性疾病患者来源的PHH。经研究，他们发现经过优化的培养基EHM（Enhanced Hepatocyte Medium），能够促使来自10种不同疾病基因突变所导致的遗传代谢性疾病患者来源的肝细胞在体外迅速增殖，并且同一疾病的多个患者表现出相似的培养结果。经过连续的细胞传代扩增，从1克肝组织中分离的肝细胞（5x106）理论上可以扩增至1000倍，最终可达到5x109数量级的扩增肝细胞，为后续治疗提供了充足的细胞来源。
随后，研究人员采用在ProliHHs基因组中定点基因敲入的治疗策略来纠正患者的基因缺陷。为了更贴近当前基因编辑细胞的临床应用标准，他们采用电转的方法将Cas9-sgRNA蛋白复合体（RNPs）和外源基因片段（Donor）递送至ProliHHs，以进行基因定点敲入表达。通过优化ProliHHs细胞的电转程序、Donor的定向整合策略和AAV亚型筛选，研究人员实现了显著高水平的敲入效率（24%-66%）。同时，经过基因编辑的细胞传代培养后，细胞保持相对稳定编辑效率。此外，研究人员还尝试富集基因编辑后的ProliHHs，并对其功能蛋白的表达进行了验证。最后，为验证编辑后患者细胞的治疗效果，研究人员培养了酪氨酸血症患者来源的肝细胞，并通过基因敲入方式纠正了患者缺陷的FAH基因。移植后，基因编辑后的ProliHHs成功地整合到FRG小鼠肝脏中，实现了小鼠模型的治疗效果。
分子细胞卓越中心张坤博士、仁济医院万平主治医生和华东师范大学王立人副研究员为该论文的共同第一作者。分子细胞卓越中心惠利健研究员、仁济医院夏强院士、华东师范大学李大力研究员、上海科技大学iHuman研究所钟桂生研究员和分子细胞卓越中心张坤博士为该论文的共同通讯作者。该项工作得到国家自然科学基金委员会、上海市科委、科技部、中国科学院等项目的资助，以及分子细胞卓越中心分子生物学技术平台、细胞分析技术平台、化学生物学技术平台、动物实验技术平台的帮助与支持。
文章链接： https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.04.022
基因编辑纠正病人来源可增殖人肝细胞实现遗传代谢性肝脏疾病治疗
