1月21日，国际学术期刊Cell Discovery在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)李劲松研究组和上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院李文团队的最新研究成果: “Generation of live mice from haploid ESCs with germline-DMR deletions or switch”。研究人员建立了融合低甲基化的孤雄和孤雌单倍体胚胎干细胞研究印记调控网络的体外模拟系统（Ha-Ha融合系统），通过删除10个印记DMR来重建印记调控网络，显著提高融合胚胎干细胞的发育潜能，有效支持四倍体补偿小鼠的足月发育。此外，研究人员还发现印记对于发育的调节功能并不受其遗传亲源性别的限制。
基因组印记是一种由DNA甲基化介导的表观遗传学调控过程，通过配子传递至受精卵，在哺乳动物发育过程中发挥重要作用。印记基因普遍成簇存在，受到差异甲基化区域（DMR）的调节，呈现单等位基因表达的特点。遗传学研究发现，DMR删除能在很大程度上模拟其高甲基化调控状态，因而这种方式经常被用来研究印记区域的基因表达调控和发育学功能。尽管既往研究表明多个印记区域在哺乳动物胚胎发育过程中发挥关键作用，但因缺少操控多个印记区域互作的在体研究工具，发育相关的印记调控网络尚未得到系统阐述。
单倍体胚胎干细胞（haESCs）作为小鼠遗传学研究的有力工具，在实现单亲生殖中发挥重要作用。在将甲基化缺失的孤雌haESCs的H19-DMR和IG-DMR删除后，其可以替代精子，高效地支持孤雌生殖小鼠的发育。而无甲基化修饰的孤雄haESCs在进行7个母源印记DMR删除后，也可以作为卵子遗传物质的替代物支持孤雄胚胎的足月发育。因此，利用haESC携带的DNA替代精子和卵母细胞的遗传物质可以作为研究印记调控网络的新思路。
为了研究发育过程中的印记调控网络，研究人员建立了一套操控父母源印记状态的研究系统。首先，研究人员在印记修饰缺失的孤雄和孤雌haESCs中分别删除父源和母源DMR，用以模拟父源和母源的印记状态。然后，通过细胞融合的方式获得重建印记调控网络的二倍体细胞。最后，通过四倍体补偿实验对二倍体细胞的发育潜能进行体内验证，进而系统性地分析被删除DMR在小鼠发育过程中的作用（图一）。利用这套系统，研究人员发现母源印记缺失的二倍体细胞只能使四倍体补偿胚胎发育至胚胎期9.5天。而经过多轮的筛选后发现，父源印记的H19-DMR和IG-DMR，与母源印记的Xist-DMR，Igf2r-DMR，Kcnq1-DMR，Gnas-DMR，Peg3-DMR，Nespas-DMR，Snrpn-DMR和Grb10-DMR的联合删除可以促进小鼠的足月发育，其中一只小鼠存活至23天（图二，a）。这个结果表明小鼠发育过程中需要复杂的印记网络调节，其中上述10个区域在胚胎发育阶段和新生儿发育阶段发挥重要作用。
此外，研究人员还发现反转DMR删除的遗传亲源模式同样可以有效地调节小鼠发育。在Ha-Ha融合系统中，将母源印记的Snrpn-DMR进行父源删除，可以参加四倍体补偿胚胎完成足月发育（图二，b）。而将H19-DMR印记修饰缺失的孤雄单倍体细胞注射进H19-DMR删除的卵子中时，也可以获得健康发育的小鼠（图二，c）。这个结果表明印记调控模式的主要功能在于调节印记基因的表达剂量，而这种功能的实现并不受其遗传亲源性别的限制。这个结论与印记“冲突”理论的基本假设相符，对于印记“冲突”理论有支持作用。
综上，本文通过Ha-Ha融合系统对多个印记调控区域进行遗传操控，证明了由H19-DMR，IG-DMR，Xist-DMR，Igf2r-DMR，Kcnq1-DMR，Gnas-DMR，Peg3-DMR，Nespas-DMR，Snrpn-DMR和Grb10-DMR组成的印记调控网络对于小鼠发育的重要意义。同时，也证明了印记调控模式并不受遗传亲源性别的限制。
上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院马永健博士和分子细胞卓越中心晏萌博士为该文共同第一作者。分子细胞卓越中心李劲松研究员和上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院李文教授为该论文的共同通讯作者。感谢分子细胞卓越中心徐国良研究员、李党生研究员、刘默芳研究员和上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院章美玲副教授对本研究的指导和帮助。该项研究得到了基因组标签计划、国家自然科学基金、国家重点研发计划、上海市科学技术重大专项和上海市科学技术委员会基础研究重大专项的资助，以及分子细胞卓越中心分子生物学技术平台、细胞分析技术平台、化学生物学技术平台和动物实验技术平台的帮助与支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41421-024-00757-x
图一，Ha-Ha融合系统的建立及其在发育中印记调控网络研究中的应用
图二，小鼠发育过程中的核心印记调控网络
