10月27日，国际学术期刊Advanced Science在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）代海强研究组联合吴薇研究组的研究成果:”HTGTS‐TCR‐Seq for Profiling of Mouse and Human T‐Cell Receptor α and β Gene Rearrangements and Diversity”。该研究基于高通量全基因组易位测序(HTGTS)技术，开发了新型DNA测序方法HTGTS-TCR-seq，旨在精准解析αβ T细胞受体（TCR）的重排过程。
TCR多样性是适应性免疫的核心，于T细胞发育过程中不同时期经历基因组V、D、J片段重排产生。Tcrb重排发生在DN3阶段，通过RAG内切酶催化断裂一个D和一个J基因元件，进而通过非同源重组末端连接（NHEJ）形成DJβ中间产物，再经过RAG断裂和NEHJ连接一个V基因元件，最终形成完整TCRβ。经历β-选择后，T细胞由DN3发育至CD4+CD8+双阳性(DP)阶段，然后发生Tcra重排，由一个V和一个J基因元件连接形成完整TCRα。传统TCR检测方法主要依赖多重PCR和5'RACE等技术，然而mRNA水平的5'cDNA末端快速扩增技术(5’RACE)受转录本丰度影响，且无法反映DNA水平的初始重排情况；DNA水平的多重PCR需大量特异性引物，始终存在引物偏倚。
在这项研究中，研究人员基于线性扩增介导的PCR技术(LAM-PCR)，通过对TCR基因片段进行有限数量的引物设计，靶向TCR基因片段，从而直接捕获基因组重排事件。该方法从源头上规避了引物偏倚，实现在DNA层面可对重组效率、功能性与非功能性TCR重排的检测分析。利用该体系，研究人员首先对小鼠胸腺细胞不同发育阶段分析，结果显示，DN3发育阶段非功能性重组频率较高，阳性选择前的双阳性胸腺细胞(preselection DP)功能性重组频率较高，与理论预期高度吻合；双阳性胸腺细胞在Tcra重排上呈现出阶梯式重排特征，印证了连续发生的初级与次级重排事件模型。在年龄相关的研究中，研究人员发现衰老改变了Vα片段的使用偏好，这一趋势在胸腺非成熟T细胞和外周成熟T细胞中均一致，提示小鼠中这一增龄性改变源于胸腺输出环节。为了进一步将方法应用推广至机制研究，研究人员对Wapl基因敲除的阳性选择前的双阳性胸腺细胞的研究，发现黏连蛋白卸载因子WAPL独立于细胞分裂的作用影响Tcra基因重排。此外，研究人员通过对人源特异性引物设计，将应用推广至人类外周T细胞样品上，展现出了临床转化应用的潜在价值。
综上，这项研究建立了新型无偏倚的基因组TCR测序方法，揭示了发育阶段特异性V/J片段使用规律及增龄性TCR变化，证实了该方法在人类样本中具有同等应用潜力，有望为T细胞发育、衰老和免疫相关疾病等研究提供新的视角。
分子细胞卓越中心代海强研究员和吴薇研究员为该论文共同通讯作者，博士研究生罗睿和宋亚伟为共同第一作者。博士研究生王美晨、邹龙昊、焦芳太和杨天歌在数据处理和材料制备等方面也做出了重要贡献。本研究得到了分子细胞卓越中心王广川研究员和香港科技大学（广州）梁卓毅教授的大力支持。项目获得了国家重点研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、上海市基础研究重大研究计划、中国科学院国际伙伴计划、国家自然科学基金、上海市自然科学基金、表观遗传调控与干预全国重点实验室开放课题、本源公益基金等项目资助。研究工作还得到了本中心公共技术服务中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和分子生物学技术平台的大力支持。特别感谢多细胞体系结构与功能重点实验室及沈义栋研究员提供衰老小鼠，感谢分子细胞卓越中心刘小龙研究员和南京大学华子春教授提供T细胞特异性工具鼠。
文章链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202509497
HTGTS-TCR-seq技术示意图
