2月12日，国际学术期刊PNAS在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组与上海交通大学医学院附属上海市第一人民医院消化内科卢洁研究组的合作研究成果，题为“Genetic recording of pancreatic beta cell proliferation”。该研究工作基于双同源重组酶系统构建了胰岛beta细胞特异性ProTracer遗传示踪系统，可用于记录生理稳态及组织再生过程中的beta细胞增殖事件。相关研究成果揭示了胰腺稳态维持、组织修复及再生过程中beta细胞的增殖动态变化规律，对于探索促进胰岛beta细胞再生的治疗策略提供了重要理论依据与研究工具。
胰岛beta细胞增殖是维持机体血糖代谢稳态的关键环节，其调控异常是糖尿病发生的核心机制之一。学界虽致力于筛选促beta细胞增殖的调控因子，但现有技术难以实现体内beta细胞增殖的长期追踪。传统检测方法如Ki67、pHH3免疫染色存在固有局限，Ki67-CreER遗传示踪仅能获取单时间点静态数据，无法捕捉长期增殖动态。因此，开发可靠灵敏的长期追踪工具，对阐明胰岛beta细胞增殖机制、研发糖尿病靶向疗法至关重要。
在该项研究中，研究团队首先利用通用型ProTracer遗传记录系统（R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-RSR-LSL-tdT）研究胰岛细胞增殖。该系统基于Cre与Dre双重组酶介导的谱系示踪技术，经他莫昔芬（Tam）诱导后，DreER进入细胞核切割Ki67-CrexER (Ki67-Cre-rox-ER-rox)等位基因中rox序列侧翼的ER片段，使CrexER转化为组成型激活Cre；随后Dre与Cre共同作用于报告基因，激活系统。理论上，单次Tam给药即可使该系统在小鼠整个生命周期内持续、无缝地捕捉并标记体内发生增殖的细胞。研究人员对成年ProTracer小鼠进行Tam处理，并分别在给药后4周、8周及12周收集胰腺组织，观察到tdT⁺阳性beta细胞比例随时间推移呈递增趋势，同时拓展分析至胰岛alpha、delta、PP细胞等其他内分泌细胞，均检测到tdT阳性细胞比例的时间依赖性上升。
通用型ProTracer系统虽能实现体内细胞增殖的长期追踪，但不具备细胞类型特异性。因此，研究人员开发了beta细胞特异性ProTracer系统。该系统由Ins2-DreER、Ki67-CrexER及R26-RSR-LSL-tdT三种品系杂交构建。DreER-rox重组可特异性激活beta细胞中的Ki67-Cre基因型，仅在Ins⁺Ki67⁺双阳性细胞中表达tdT，实现beta细胞增殖过程的特异性示踪。研究人员对成年beta细胞-ProTracer小鼠进行Tam处理，不同时间点的胰腺组织分析显示，tdT阳性beta细胞比例呈逐步上升趋势。免疫染色证实绝大多数tdT阳性细胞为beta细胞，验证了系统的高特异性。团队还基于细胞周期基因Ccna2构建了替代版本系统，检测数据与Ki67系统高度相似，进一步精准量化了成年小鼠稳态下beta细胞增殖速率。
为了探究增殖性beta细胞的分子特性及其潜在异质性，研究团队从beta细胞特异性ProTracer小鼠体内分离胰岛细胞并进行单细胞转录组测序（scRNA-seq）分析。聚类分析显示beta细胞可分为4个具有不同转录特征的亚群，而tdT转录本在4个beta细胞亚群中呈均匀分布，提示增殖性beta细胞并不构成独立的转录特征亚群。GO富集分析显示tdT⁺细胞上调基因主要富集于核糖体生物发生及翻译相关功能条目。tdT+ beta细胞中显著上调的基因数量有限，这种微弱的转录差异与ProTracer系统的累积性记录特性相符：该系统标记的是整个示踪窗口内所有发生过增殖的细胞，而非仅在检测时处于活跃分裂状态的细胞。提示大多数增殖后的beta细胞在组织收集时其转录状态已恢复至与非增殖beta细胞相似的水平。此外，研究团队采用克隆分析方法（Ins2-DreER;Ki67-CrexER;R26-Confetti）对增殖性beta细胞进行研究，低剂量Tam处理后经一段时间观察发现绝大多数细胞克隆由单个细胞或成对细胞组成，并未观察到由大量beta细胞构成的克隆群，提示在示踪周期内进入细胞周期的beta细胞其后续增殖输出能力不存在显著异质性。
为验证系统在损伤修复模型中的作用，团队对beta细胞-ProTracer小鼠实施胰腺部分切除术（PPX），与对照组小鼠相比，PPX组小鼠的tdT荧光信号显著增强，表明该系统能够有效捕捉PPX引发的beta细胞增殖增强效应。药物干预实验中，Tam处理后经一段时间洗脱期，对小鼠每日腹腔注射哈马灵（DYRK1A抑制剂）与GW788388（TGFbeta超家族抑制剂）联用药物，结果显示处理组tdT阳性beta细胞比例显著高于对照组，证实该系统可准确检测药物诱导的增殖变化，具备药物筛选潜力。针对胰腺导管结扎术（PDL）对beta细胞增殖的影响争议，团队对小鼠实施PDL后，对比损伤尾部与对照头部的tdT阳性beta细胞数量发现无显著差异，表明PDL未明显促进beta细胞增殖。
总体而言，本研究基于双重组酶系统构建了beta细胞-ProTracer遗传示踪系统，可用于记录生理稳态及组织再生过程中的beta细胞增殖事件。本研究发现稳态条件下，beta细胞增殖事件随时间推移逐渐增多，并且增殖性beta细胞的增殖潜能具有均一性。本研究通过PPX与药物刺激两种方式验证了ProTracer系统在beta细胞增殖监测中的功能应用，证实了该系统在量化beta细胞增殖水平方面的有效性，同时明确PDL对beta细胞增殖并无显著促进作用。该系统为beta细胞增殖研究提供了重要工具，有望推动胰腺再生及糖尿病治疗策略的发展。
分子细胞卓越中心副研究员赵欢、博士生陈惠和国科大杭州高等研究院博士后康志鑫为该论文共同第一作者。分子细胞卓越中心周斌研究员和上海交通大学医学院卢洁教授为该论文共同通讯作者。该研究得到分子细胞卓越中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和南模生物的大力支持和帮助。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委、新基石科学基金会和赛诺菲优秀青年人才奖励基金等支持。
文章链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2507877123
通用型ProTracer与beta细胞-ProTracer遗传示踪系统的建立
