2月27日，国际学术期刊Nucleic Acids Research在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）吴立刚研究组联合上海交通大学医学院邹琳研究员的最新研究成果：“Characterization of gRNA-dependent and gRNA-independent off-target binding sites of PspCas13b and RfxCas13d in mammalian cells”。该研究开发了检测RNA结合蛋白（RBP）在RNA上结合位点的高灵敏、高信噪比深度测序方法uSpyCLIP，并运用该技术揭示了两种目前应用最为广泛的Cas13核酸酶——Prevotella sp. P5-125 (Psp)Cas13b和Ruminococcus flavefaciens XPD3002 (Rfx)Cas13d的gRNA依赖性以及gRNA非依赖性脱靶结合位点的特征，为未来RNA编辑、检测和治疗应用中Cas13和gRNA的优化设计提供了宝贵的指导。
基于VI型CRISPR-Cas系统的RNA编辑技术，因其结构简单且具备可编程的RNA靶向能力而备受关注。该系统可分为六种亚型，其中，PspCas13b和RfxCas13d的应用最为普遍，已在多种细胞系和模式生物中成功实现对信使RNA（mRNA）及长链非编码RNA（lncRNA）的敲低。更重要的是，切割活性丧失的dPspCas13b和dRfxCas13d变体可通过融合碱基编辑器或者其他功能蛋白用于RNA编辑、RNA成像以及转录后调控等众多领域，在疾病治疗及核酸检测中具有巨大的应用潜力。因此，确保dCas13-gRNA系统的靶标特异性变得尤为关键。然而，过往研究主要集中于对有限数量的候选脱靶位点开展体外切割活性检测；尽管RNA深度测序可检测转录组丰度变化，但仅局限于鉴定脱靶切割，无法提供无切割活性的dCas13-gRNA复合物无偏差、全转录组范围的脱靶结合位点图谱。这些局限性制约了对dCas13-gRNA复合物的靶标特异性与识别规则的发现和分析。
紫外交联与免疫沉淀（CLIP）是一种强大的技术，能够以单碱基分辨率鉴定RNA结合蛋白（RBP）和核糖核蛋白（RNP）复合物的直接RNA靶标。在本研究中，研究人员开发出一种名为ultra SpyCLIP（uSpyCLIP）的技术。该技术通过最小化RBP融合标签设计，有效降低了对RBP活性的干扰，在识别RBP结合位点时兼具高灵敏性和出色的特异性，与其他类似方法相比可以在相同测序深度下检测到更多的结合位点，并支持仅使用1000个细胞完成RBP结合位点图谱测定。此外，uSpyCLIP技术完全依托磁珠进行操作，便于实现自动化并减少人工投入，整个流程仅需两天便可完成，是目前最高效的CLIP方法之一。
研究人员运用uSpyCLIP技术，绘制出dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA复合物在转录组中的结合位点分布图谱。研究显示，dCas13的结合行为比先前预想的更为广泛。两种dCas13-gRNA复合物均呈现大量的脱靶结合事件。根据其是否依赖于gRNA，可以分为gRNA依赖性的（gRNA-dependent）脱靶和gRNA非依赖性的（gRNA-independent）脱靶。进一步地，研究人员对两种dCas13-gRNA复合物的脱靶结合行为进行了表征和验证，证实dCas13蛋白的gRNA非依赖性脱靶位点具有独特的RNA识别位点结构和序列特征：dPspCas13b的脱靶结合与特定RNA结构特征相关，而dRfxCas13d的脱靶结合则与特定的序列基序相关。对gRNA依赖性脱靶位点的分析发现，gRNA的DR远端区和中部区域在决定结合特异性中的关键作用：PspCas13b gRNA间隔区前20个核苷酸中10个碱基的完全配对足以介导结合，而RfxCas13d gRNA间隔区第11-30个核苷酸中7个碱基的完全配对则足以介导结合。进一步研究发现，以上部分脱靶事件能够导致非靶标基因的mRNA和/或蛋白质水平基因表达发生变化。这些结果表明，基于dCas13或dCas13-效应子融合蛋白的应用，例如转录后调控、RNA成像和RNA编辑，可能会因脱靶结合而产生复杂的毒副作用。此项研究为检测Cas13的脱靶结合位点提供了全新的技术手段与研究策略，深化了对Cas13系统的认知，为特异性gRNA的合理设计以及Cas蛋白的工程改良提供了重要的理论基础和支撑。
分子细胞卓越中心助理研究员冯欢欢和博士研究生李志学为该论文的共同第一作者。分子细胞卓越中心吴立刚研究员和上海交通大学医学院邹琳研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到了分子细胞卓越中心细胞分析技术平台、分子生物学技术平台、生物信息学平台和高性能计算存储与网络服务中心的大力支持，同时得到了中国科学院、国家自然科学基金委、科技部的经费支持。
文章链接：https://academic.oup.com/nar/article/54/4/gkag112/8494760
dPspCas13b-gRNA和dRfxCas13d-gRNA复合物脱靶结合位点的特征
