3月30日，国际学术期刊Cell Discovery在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组的研究成果，题为“Highly regional generation and heterogeneous differentiation of basal cells in mouse trachea”。该研究工作构建了不同的增殖示踪系统，可以实现在气管中特异追踪基底细胞增殖的目的。利用这些系统，该研究揭示气管基底细胞增殖在生理稳态下具有区域异质性，其中背侧基底细胞的增殖要远高于腹侧基底细胞，这一增殖过程受经典的WNT信号通路调控。该研究成果为理解气管基底细胞异质性以及基底细胞如何维持干细胞库提供了新的视角，为上皮在疾病过程中的损伤修复提供了新的理解方向。
气管是呼吸系统的重要组成部分，形态学上气管在背侧与腹侧具有异质性：腹侧具有C型的软骨环，背侧则被平滑肌包绕。气管上皮主要由三种细胞构成：基底细胞、杯状细胞以及纤毛细胞，其中基底细胞作为干细胞通过增殖分化贡献至另外两种细胞类型。基底细胞在过去的研究中一直被认为存在异质性，许多研究利用单一标志物进行谱系示踪发现一些特定的基底细胞亚群可能具备更强的增殖扩增能力，但是这些研究依赖特定的标志物容易忽略基底细胞整体的观察。另外也有体外的研究表明背侧的基底细胞具备更强的克隆形成能力，因此领域内缺少在体内对整体基底细胞增殖水平的异质性研究。
在该研究中，研究团队首先利用先前发表的基于Cre与Dre双同源重组酶介导的增殖示踪体系ProTracer（R26-DreER;Ki67-CrexER;R26-GFP）研究气管上皮增殖。经过tamoxifen（Tam）诱导后，需要诱导的Ki67-CrexER（Cre-rox-ER-rox）因为DreER入核识别rox后重组掉ER序列而被转变成不需要诱导的Ki67-Cre,此后细胞增殖时间均可被Ki67-Cre驱动标记的R26-GFP示踪。经由该系统，研究人员发现小鼠气管中的三种主要上皮细胞均具有区域增殖的特点：三种类型细胞背侧增殖均要高于腹侧增殖。
基底细胞作为主要的干细胞来源，研究人员构建了基底细胞特异的系统（basal cell functional ProTracer, BC-fProTracer）来进行后续的增殖示踪。BC-fProTracer系统由P63-CreER;Ki67-L-Dre;R26-RL-GFP三种品系杂交构建，在Tam诱导后，基底细胞中CreER入核，将Ki67-L-Dre中的loxP-stop-loxP序列重组最终得到Ki67-Dre，基底细胞的增殖最终被Ki67-Dre与P63-CreER共同驱动标记的R26-RL-GFP进行最终示踪。与广谱性的增殖示踪结果一致，基底细胞在背侧增殖的速率远高于腹侧。基底细胞特异的增殖示踪系统在四周的时间窗内也捕捉到了部分的腔细胞（主要是杯状细胞），连续的细胞切片表明其中一些杯状细胞来源于基底细胞的非对称分裂。除了增殖后非对称分裂产生腔细胞，研究人员将BC-fProTracer与直接的基底细胞示踪结合后发现基底细胞转变为腔细胞主要分为两种方式：一种是不经由分裂的直接转变，另一种是经由非对称分裂。这一发现也进一步证明了基底细胞的功能异质性：一部分负责对称分裂维持干细胞库，一部分负责直接分裂产生效应细胞，在这两个主要部分之外是一些经由非对称分裂产生腔细胞的亚群。
为了研究基底细胞的克隆性增殖，研究人员通过引入一个Cre与Dre双同源重组酶介导的克隆报告基因系统（R26-Confetti2）进一步确认了基底细胞的区域增殖扩增异质性。Tam诱导后，与BC-fProTracer相似基底细胞中P63-CreER入核与Ki67-L-Dre转变后的Ki67-Dre共同驱动R26-Confetti2的表达，将增殖的细胞进行不同色的克隆标记。随着追踪时间的延长，克隆会进行扩增，克隆的多少以及大小均能反应基底细胞的增殖扩增能力。研究人员进行统计显示，在稳态下背侧基底细胞增殖后产生的克隆更大更多，这也进一步印证了前文的结论：气管背侧的基底细胞具备更强的增殖扩增能力。
研究人员还进一步引入了不同的气管损伤模型来探究损伤下的气管基底细胞的增殖模式。分析发现，不同于稳态下背侧的基底细胞具备更强的扩增能力，损伤后克隆分析表明背侧与腹侧的基底细胞具备相似的克隆扩增能力。损伤后背侧与腹侧基底细胞扩增的模式不同，背侧的基底细胞损伤后更倾向于扩增形成基底细胞而腹侧的基底细胞损伤后更倾向于扩增形成杯状细胞与纤毛细胞。这一发现不仅揭示了气管背侧与腹侧基底细胞应对损伤的不同模式也验证了BC-fProTracer在背侧与腹侧中等同的增殖捕捉能力。
研究人员为了探究这些基底细胞的增殖调控机制，首先对基底细胞敲除β-catenin的实验组与对照组进行了单细胞测序分析。分析发现，破坏经典的WNT信号通路后，基底细胞中的细胞周期相关基因具有明显的下调。伪时序分析发现经典WNT信号通路下调后基底细胞更倾向于向腔细胞进行命运转变。利用BC-fProTracer系统可以在基底细胞中敲除基因的同时追踪这些细胞的增殖特性，来研究细胞内在的基因调控增殖的模式。研究人员研究了基底细胞敲除β-catenin后的增殖变化。分析发现敲除β-catenin后，无论是背侧还是腹侧基底细胞的增殖均有减少。除此之外，背侧腹侧中基底细胞增殖来源的腔细胞（主要是杯状细胞）明显增多。这一发现说明经典的WNT信号通路维持着基底细胞的对称分裂模式以维持气管中的干细胞库，而破坏这一信号通路使得干细胞命运更多地通过增殖分化转变为杯状细胞或纤毛细胞。
除了以上发现外，本研究还补充了前人对于气管基底细胞异质性的研究：1）丰富了关于基底细胞中Hillock细胞的学说，证明Hillock并不是气管中唯一的稳态与损伤下的干细胞库，背侧气管中的其他非Hillock基底细胞也维持着较高的增殖扩增能力来维持干细胞库。2）首次直接提供了气管基底细胞中至少存在两个亚群的直接在体证据：一个亚群负责对称分裂产生基底细胞维持干细胞库（multipotent basal stem cells），一个亚群负责直接分化产生腔细胞（basal luminal progenitors）。
综上所述，本研究以多种谱系示踪工具证明了气管背侧与腹侧基底细胞的增殖异质性，并发现在基底细胞中存在两个功能特化的亚群：一个负责对称分裂产生更多基底细胞维持干细胞库；另一个负责直接分化产生腔细胞。这两种亚群的命运决定依赖于基底细胞中经典的WNT信号通路。本研究深化了气管基底细胞的异质性研究，从增殖能力出发发现了基底细胞的区域异质性，提供了基底细胞亚群的在体证据。并进一步利用WNT经典信号解释了两个亚群之间维持的平衡，为气道上皮损伤修复提供了新的视角。
分子细胞卓越中心助理研究员刘秀秀、博士研究生翁文栋和博士研究生何桢为该论文的共同第一作者。分子细胞卓越中心周斌研究员和蒲文娟副研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到分子细胞卓越中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台和南模生物的大力支持和帮助。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委、新基石科学基金会和科学探索奖等支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41421-026-00887-4
基底细胞增示踪工具BC-fProTracer的工作原理示意图，该系统由三部分组成：P63-CreER;Ki67-L-Dre/+;Reporter (该研究使用了两种报告基因：1) R26-RL-GFP; 2) R26-Confetti2)。Tam诱导后，基底细胞中P63-CreER入核与Ki67-L-Dre转变后的Ki67-Dre共同驱动R26-RL-GFP或R26-Confetti2的表达来标记增殖的基底细胞。稳态下，基底细胞增殖主要富集在气管背侧，同时基底细胞增殖在背侧腹侧产生少数杯状细胞。敲除β-catenin后，基底细胞增殖产生新的基底细胞减少，而增殖产生的杯状细胞则变多。
