6月12日，国际学术期刊Cell Research在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）李逸平研究组和李劲松研究组的合作研究成果，题为“One-step generation of semi-cloned zebrafish carrying a defined genetic modification”。研究团队历经8年的艰苦探索，成功开发了一种高效的斑马鱼半克隆技术，成功率最高可达30%，有望破解斑马鱼基因编辑中长期存在的“嵌合体”、“耗时长”等核心难题。
半克隆技术是一种独特的动物个体制备方法，其核心在于使用单倍体胚胎干细胞（haESCs）替代精子，注入卵母细胞后形成可存活的个体。研究人员曾经成功从小鼠单倍体囊胚中培育出孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs），将其作为精子替代物，注入成熟卵母细胞，成功支持胚胎完成全周期发育，所产生的活体动物被称为“半克隆动物”。通过技术改进，可高效支持半克隆小鼠的生成，小鼠DKO-AG-haESCs 可作为基因操控性受精载体，通过一次性注射携带基因编辑器或复杂基因组修饰的该类细胞，实现生物体水平的遗传学分析。此外，研究人员也先后在大鼠、牛、羊、灵长类、人类等物种中建立单倍体胚胎干细胞，并尝试获得半克隆动物，但成功率普遍很低。
斑马鱼作为研究脊椎动物发育与疾病的关键模式生物，具有繁殖便捷、胚胎透明、胚胎发育迅速等诸多优势。目前，通过向受精卵注射CRISPR/Cas9进行基因编辑是主流方法。然而，该策略存在体细胞嵌合现象，子代基因型不一致。为获得纯合突变体，通常需要进行大量筛选与繁育工作，这一过程费时费力，往往需耗时6至9个月，且效果不佳；且对于胚胎致死基因，难以获得稳定突变品系。因此，如何高效、快速地制备基因编辑斑马鱼模型，一直是研究领域内的重要难题。
在本研究中，团队成功研发出斑马鱼半克隆技术，与小鼠系统使用单倍体胚胎干细胞不同，本研究使用了具有干性的新鲜囊胚期单倍体细胞作为供体细胞。团队曾初步尝试建立斑马鱼单倍体胚胎干细胞系，虽然获得稳定的单倍体细胞系，但注入卵母细胞后无法支持胚胎完成全程发育。经分析认为，可能是因为这些细胞已分化为成纤维细胞，不再适合作为半克隆的供体细胞。因此，本研究转而选用新鲜囊胚期单倍体细胞，成功获得了可育的半克隆斑马鱼。通过不断优化技术，半克隆斑马鱼的制备成功率提升至约30%，具备了广泛应用的潜能。
李逸平团队着力探索完善并逐年积累的四大技术的优势，有效解决了制约研究和制模难题。首先，通过单倍体囊胚细胞核移植技术，能够从根本上消除嵌合现象，因为每个单倍体供体细胞仅携带单一基因型，从而获得性状均一的半克隆鱼。其次，在单倍体胚胎中进行多重基因编辑可实现多基因编辑一步到位，获得多种基因型组合的供体细胞，并同时产生雌、雄半克隆斑马鱼，经后续繁育即可在F1代直接得到基因纯合突变个体。第三，结合PCR分析与囊胚细胞低温保存方法，能高效制备基因敲入斑马鱼。最后，利用核移植-半克隆（NT-SC）串联技术，让基因编辑细胞进行“克隆扩增”，然后对细胞克隆进行基因型鉴定，确定后再作为供体产生半克隆斑马鱼，能大大提高基因编辑半克隆个体的制备效率。
综上所述，这项研究不仅填补了斑马鱼半克隆技术的空白，更重要的是通过联合应用囊胚细胞冷冻保存、供体细胞PCR预筛选及囊胚细胞核移植扩增等技术，使得半克隆系统成为斑马鱼遗传分析的强大平台。未来的挑战在于建立稳定的斑马鱼单倍体胚胎干细胞系，以替代新鲜囊胚期胚胎细胞用于半克隆鱼的制备；这些可进行体外基因编辑的培养细胞，有望进一步提升制备基因修饰动物的效率。
分子细胞卓越中心博士后艾怡瑞、李世峰副研究员、刘思奇博士、续佳博士为论文共同第一作者。分子细胞卓越中心李逸平研究员和李劲松研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到了李党生、潘巍峻等专家的指导，获得科技部重点研究计划、上海市科技重大专项等资助，并得到分子细胞卓越中心刘小龙研究组以及斑马鱼技术平台、GTP研发中心、果蝇资源与技术平台等方面的支持和帮助。
文章链接: https://www.nature.com/articles/s41422-026-01266-0
斑马鱼半克隆技术流程图
