8月20日，国际学术期刊Cell正式发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组联合德国马克斯·普朗克分子生物医学研究所Ralf H. Adams团队的最新成果“Lymphatic vessels invade bone in disease but are absent in health and regeneration”。该研究通过构建双同源重组酶介导的淋巴管内皮细胞示踪新技术，系统揭示了生理稳态、再生修复及病理条件下骨骼周围淋巴管的分布与动态，阐明了骨外淋巴管在病理条件下主动侵袭骨组织的完整过程及细胞来源。该工作澄清了“骨骼中是否存在淋巴管”这一领域内长期存在的学术争议，并为广泛性淋巴管异常（Generalized Lymphatic Anomaly, GLA）与Gorham–Stout病（Gorham–Stout Disease, GSD）等罕见淋巴管疾病的治疗干预提供了潜在新策略。
淋巴管系统是循环系统的重要组成部分，由毛细淋巴管、集合淋巴管及淋巴导管构成，其管壁由淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cell, LEC）构成，广泛分布于全身多数器官。淋巴管主要承担两项生理功能：一是组织液平衡，即回收从血管毛细血管渗漏至组织间隙的液体及大分子物质，将其回输至血液循环，以防止水肿形成；二是免疫监视，即通过转运抗原及免疫细胞至区域淋巴结，启动适应性免疫应答，参与病原体清除与组织稳态调控1。尽管淋巴管广泛分布于皮肤、心脏、肺、肠道等器官，但骨骼中是否存在淋巴管一直是血管生物学及基础医学领域的争议焦点。传统观点认为健康的骨骼系统缺乏淋巴管，而骨骼中淋巴管的出现通常代表异常的病理状态2-6。然而，近期有研究基于多种LEC标志物（包括LYVE1、PDPN和PROX1）的全骨免疫标记及光片显微镜技术提出相反结论，认为正常骨骼中存在淋巴管，并可在损伤后参与骨骼再生并支持造血细胞再生7。澄清这一问题不仅具有基础生物学意义，更直接关系到对GLA与GSD这两种罕见淋巴管疾病病理机制的理解。此类疾病患者骨骼内出现异位淋巴管并伴有进行性骨溶解，但其细胞来源及形成机制尚存在争议3。
此前部分研究基于LYVE1、PDPN等单一淋巴管标记物识别骨骼中的淋巴管。然而，这些标记物均存在细胞谱系特异性不足的局限7。研究人员发现，LYVE1除了标记LEC外，还会表达于免疫细胞及部分内皮细胞；PDPN则可在骨髓间充质细胞中表达。转录因子PROX1是LEC分化的重要调控因子，Prox1-CreER遗传工具是淋巴管领域内普遍使用的LEC标记示踪工具8。研究人员首先对传统的单同源重组酶驱动的谱系示踪工具进行了系统性鉴定。Prox1-CreER;R26-tdT工具小鼠经他莫昔芬诱导后，研究人员分别进行了全骨免疫标记以及骨组织连续切片的免疫荧光成像分析，发现大部分tdT阳性细胞广泛分布于骨外膜的纤维层以及骨骼周围的肌肉和结缔组织中。然而进一步分析发现，由于PROX1广泛表达于神经元、心肌细胞、肝细胞及骨骼肌细胞等非内皮细胞谱系，该遗传工具除了高效率标记LEC外，还会“非特异”标记上述多种非内皮细胞谱系。这使得Prox1-CreER所标记的tdT信号无法准确区分真正的LEC与非LEC群体，为研究结果的解读带来了不确定性。单细胞测序数据的进一步分析也印证了这一不确定性。先前的研究对两名癌症患者的骨组织进行单细胞RNA测序，发现了包含LEC亚群在内的一些内皮细胞亚群7。然而，上述测序数据中同时表达Cdh5（编码VE-cadherin）和PECAM1/CD31的真正内皮细胞数量极少（<60个细胞）。在大多数亚群中可检测到一定水平的Pecam1表达，但这些细胞缺乏Cdh5转录本，并表达多种造血细胞群的标志物（最显著的是编码免疫细胞标志物CD45的PTPRC），这与小鼠造血细胞中低水平Pecam1表达的数据一致。最值得注意的是，该数据中仅含极少数PROX1+细胞，且其中大多数缺乏Cdh5表达，进一步提示PROX1+的非内皮细胞谱系干扰实验结果。以上结果表明，由于LYVE1、PDPN和PROX1均无法特异性地将LEC与其他细胞类型区分开来，因此无论是基于单一蛋白标志物的免疫染色，还是传统的Prox1-CreER遗传示踪工具，仅依赖这些方法识别骨骼中的淋巴管，极易受到非特异性信号的干扰，导致结论偏差。
为了攻克上述技术瓶颈，实现对LEC的高特异性示踪，研究人员开发了由Cre-loxP与Dre-rox双同源重组酶介导的淋巴管内皮细胞谱系示踪系统——LEC-iCre（Cdh5-Dre;Prox1-RSR-CreER）9。Cdh5是血管内皮标志物，利用内皮细胞特异性工具Cdh5-Dre介导的Dre-rox重组，将CreER的表达限制于内皮细胞来源的PROX1+的LEC中。将LEC-iCre与R26-RL-tdT报告小鼠杂交后，经他莫昔芬诱导，只有内皮细胞来源的PROX1+的LEC中能够表达Dre和Cre两种重组酶从而被标记为tdT，非内皮来源的PROX1+谱系因缺乏Cdh5表达而不被标记，从而实现了对LEC的高精度、高特异性遗传标记与谱系示踪，排除了非目标细胞谱系的干扰。全组织荧光成像显示心脏、胃、肠系膜、小肠等器官呈现清晰的淋巴管特异性tdT信号。免疫染色证实，仅PROX1+LYVE1+或LYVE1+CD31+ LEC被tdT标记，而肝细胞、心肌细胞、神经细胞及其他细胞类型中都无tdT信号。利用该高特异性LEC遗传工具，研究人员对全骨进行3D重建后发现tdT信号仅位于骨骼表面。高分辨率连续切片免疫荧光染色和统计分析显示，93.82±2.76%的PROX1+ LEC被高效标记。进一步共染tdT和Periostin将这些tdT+ LEC定位于骨膜的纤维层，而非骨骼内部。他莫昔芬给药一个月后，tdT+ LEC仍局限于骨膜及周围结缔组织，并未进入骨骼内部。以上结果证实，在生理稳态下，骨小梁、皮质骨和骨髓等骨性结构中并不存在淋巴管。
为验证辐照损伤后淋巴管是否会进入骨骼内部参与造血和骨骼再生，研究人员首先对LEC-iCre；R26-RL-tdT工具小鼠进行他莫昔芬处理，随后进行辐照和骨髓移植。辐照后骨骼中EMCN+血管明显扩张，同时伴随造血细胞减少，证实辐照后造血干细胞受损且骨骼中发生了活跃的血管重塑。然而，对损伤后的骨组织进一步分析显示，tdT+ LEC仍然局限于骨膜，辐照后并未侵入骨骼。统计结果表明，结缔组织中93.91±2.34%的LYVE1+CD31+ LEC被tdT高效标记，但在移植后不同阶段（最长66天）均未检测到骨内tdT+ 淋巴管。研究人员同样在Prox1-CreER;R26-tdT工具小鼠中进行了辐照损伤实验，结果显示，97.28±1.37%的LYVE1+ CD31+ LEC被高效标记，但仅限于结缔组织和骨膜中。以上结果表明，辐照后骨再生过程中淋巴管不会进入骨骼内部参与再生修复。
骨折可诱导引流淋巴管扩张和淋巴结肿大，进而影响炎症和骨骼愈合过程。为探究机械损伤能否触发淋巴管向骨内生长，研究人员对LEC-iCre;R26-RL-tdT小鼠的股骨进行了骨折损伤。研究人员在骨折后不同阶段收集骨骼进一步分析后发现，骨折后第一周，骨折部位形成软骨痂，tdT+ LEC较正常骨组织显著扩增，但仍位于骨痂及骨膜中，未进入骨内。骨折损伤后两周，随着活跃成骨作用和矿化的进行，软骨痂逐渐转化为纤维性或硬性骨痂。骨痂中tdT+ LEC数量进一步增加，尤其是富含血管的纤维性骨痂区域。统计显示，骨折后骨膜和骨痂中90% 以上LYVE1+CD31+LEC表达tdT，而骨内未检测到tdT+ LEC。在Prox1-CreER;R26-tdT小鼠的骨折模型中，由于PROX1在多种细胞谱系中表达，tdT信号广泛分布于肌肉和结缔组织，且在CD31−LYVE1−的软骨细胞和新生骨中有少量信号，但同样未检测到tdT+LYVE1+CD31+ LEC进入矿化的骨组织。以上结果表明，LEC特异性Cre遗传工具有效捕捉了骨折后LEC的显著扩增，但扩增的LEC始终局限于骨膜和骨痂纤维区，并未侵入骨组织。
与生理状态形成鲜明对比的是，在模拟GLA/GSD的突变小鼠模型中，研究团队实时捕捉到了淋巴管“越界”的全过程。GSD是一种罕见的骨病，1838年由J.B.S. Jackson首次报道，他描述了一位患者的上臂骨在数年内逐渐“消失”的病例。1955年，Gorham和Stout通过对8例患者组织样本的系统分析，确认该病以骨内大量增生性血管样通道为组织学特征，并正式将其命名为Gorham–Stout病。GSD可累及全身任何骨骼，但好发于下颌骨、锁骨、肋骨、颈椎、骨盆和股骨。患者常表现为局部疼痛、肿胀、肢体无力及功能障碍，严重者可因胸椎受累导致乳糜胸（富含脂肪的淋巴液在胸腔内异常积聚），引发呼吸困难甚至呼吸衰竭；脊柱受累则可能导致严重神经功能缺损、畸形、瘫痪甚至死亡。目前该病尚无特效疗法，临床上常用雷帕霉素等药物尝试控制病情。关于GSD中过度骨吸收的原因，学界长期存在争议。Gorham和Stout最初认为，骨内异常增生的血管可能通过增加局部血流、改变pH或施加机械压力来促进骨丢失。随着LYVE1和PDPN等淋巴管内皮细胞分子标记物的出现，研究者发现GSD患者骨内存在大量异常淋巴管，提示淋巴管可能是疾病发展的主要受累对象5。此前对9名GLA患者的病变组织样本及分离的LEC进行的高通量测序研究进一步发现，部分患者存在PIK3CA（编码PI3K p110α催化亚基）的功能获得性体细胞突变，其中包括His1047Arg（H1047R）错义突变。基于此，既往研究结合Prox1-CreER遗传工具构建Pik3caH1047R突变小鼠模型模拟GLA，发现在PROX1+细胞谱系中PI3K信号的过度激活可驱动淋巴管异常增生并导致功能障碍，进而引发骨内淋巴管的病理性侵袭2。然而，由于Prox1-CreER遗传工具存在“非特异”标记多种非LEC的问题——PROX1不仅表达于淋巴管内皮细胞，还广泛表达于肌肉细胞、神经元、肝细胞及心肌细胞等——因此直接使用该工具进行基因操作或谱系示踪，难以区分观察到的表型究竟源于淋巴管内皮细胞还是其他细胞谱系所带来的混杂影响。在本研究中，研究人员利用双重组酶介导的遗传示踪技术，实现了对淋巴管内皮细胞的高特异性标记与基因操作。研究人员首先构建了R26-LSL-Pik3caH1047R-tdT（R26-Pik3caH1047R-tdT）小鼠品系，并将其与诱导型LEC遗传工具（Cdh5-DreER;Prox1-RSR-CreER）小鼠杂交，获得Cdh5-DreER;Prox1-RSR-CreER;R26-Pik3caH1047R-tdT三阳性小鼠。在该系统中，只有同时表达Cdh5和PROX1的LEC，才会在他莫昔芬诱导后特异性过表达Pik3caH1047R突变，同时激活tdT报告基因实现细胞命运示踪。研究人员随后在诱导后不同阶段分别收集骨骼进行时序分析以观察淋巴管的动态变化。通过这一策略，研究人员成功排除了其他细胞谱系的干扰，首次在体内明确观察到：骨膜外层的LEC在突变驱动下显著增生，依次突破骨膜、侵蚀皮质骨，最终侵入骨髓腔。借助谱系追踪技术，这一病理过程的全貌得以直观呈现。这一发现确证了GLA/GSD中骨内淋巴管来源于骨外淋巴管的主动侵袭，为GLA与GSD这两种疾病的发病机制提供了直接的遗传学证据。
综上，该研究通过构建精准的双同源重组酶介导的遗传谱系示踪系统，实现了对淋巴管内皮细胞的特异性示踪与基因操作，并在此基础上系统解析了生理与病理条件下骨骼中淋巴管的分布与动态。该研究不仅澄清了“骨骼中是否存在淋巴管”这一基础科学问题，更为GLA与GSD这两种目前缺乏有效治疗手段的罕见病提供了明确的病理机制。
分子细胞卓越中心周斌研究员和德国马克斯·普朗克分子生物医学研究所Ralf H. Adams教授为该论文的共同通讯作者。上海科技大学博士生孟鑫凤和国科大杭州高等研究院特聘研究员刘扩为该论文共同第一作者。该研究得到上海南方模式生物科技股份有限公司、分子细胞卓越中心动物实验技术平台和细胞分析技术平台以及上海科技大学分子影像平台的大力支持。该研究得到了中国国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、上海市市级科技重大专项、杭州市高等研究院项目、新基石研究员项目，以及德国马克斯·普朗克学会、欧洲研究理事会和德国研究基金会的联合资助。
文章链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)00639-2
生理与病理条件下骨组织中淋巴管的空间分布
在生理稳态下，淋巴管定位于骨膜外层及周围结缔组织中，不存在于骨骼内部。辐照损伤后的骨再生过程中，淋巴管不会进入骨骼内部参与再生修复。骨折损伤后，骨膜处形成软骨痂，淋巴管在骨膜和骨痂区域显著扩增，但并未侵入骨组织。而在模拟GLA/GSD的病理条件下，骨膜外层的淋巴管在突变驱动下显著增生，突破骨膜、侵蚀皮质骨和骨髓腔。
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