10月7日，国际学术期刊Nature以Research Article的形式在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）/国科大杭州高等研究院周斌研究组的最新成果“Alveolar stem cells transdifferentiate to drive bronchiolar regeneration”。该研究建立了Cre-loxP和Dre-rox双同源重组酶介导的遗传谱系示踪新技术，结合多种小鼠支气管损伤模型，系统研究了支气管上皮损伤后肺泡II型上皮细胞（AT2 cell）跨区域迁移并转分化为支气管上皮细胞、促进再生修复的过程，并揭示了参与细胞命运调控的分子机制。该研究不仅为肺脏疾病治疗研究提供了新的科学依据和突破口，也为器官发育和再生医学研究提供了新的技术方法。
维持肺脏结构和功能的稳定对于人类生存至关重要。肺上皮干细胞在肺损伤后的再生修复中扮演核心角色，是肺再生与疾病研究领域的前沿热点。以小鼠肺脏为例，肺叶内部主要包含支气管和肺泡两个解剖学上截然不同的区域。不同区域的肺上皮细胞种类和数量各异，各自拥有负责局部稳态维持与损伤修复的干细胞。支气管上皮主要由棒状细胞（Club cell，分子标记为Scgb1a1）、纤毛细胞（Ciliated cell）和神经内分泌细胞（Neuroendocrine cell, NE cell）等构成，其中club细胞和NE细胞作为干细胞维持支气管上皮更新。支气管上皮是肺与外界环境之间的第一道防线，其结构与功能的完整性对维持肺脏稳态至关重要：上皮细胞通过紧密连接形成物理屏障，防止吸入性病原体和有害物质侵入；分泌细胞（如club细胞和杯状细胞）产生宿主防御肽和蛋白等抗菌分子；纤毛细胞通过协调摆动将黏液及异物向咽部清除，执行黏液纤毛清除功能。因此，支气管上皮的再生修复能力直接关系到肺部抵御病原菌感染和组织稳态的维持。当这一再生过程受损时，会导致上皮屏障破坏、修复缺陷及气道重塑，进而参与慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等重大呼吸系统疾病的发生发展。
肺泡上皮主要由I型肺泡上皮细胞（Alveolar type I cell, AT1 cell）和II型肺泡上皮细胞（Alveolar type II cell, AT2 cell，分子标记为Sftpc）构成，其中AT2细胞作为肺泡干细胞能自我更新并分化为AT1细胞；在支气管和肺泡区域交界处，还存在一群支气管肺泡干细胞（Bronchioalveolar stem cells, BASCs），同时表达Scgb1a1和Sftpc。周斌团队前期研究揭示BASCs在肺损伤后具有向支气管和肺泡上皮双向分化潜能，以及支气管club细胞能够动员参与肺泡修复，然而肺泡AT2细胞能否逆向跨区域参与支气管上皮修复，尚不清楚。由于领域内研究AT2细胞的传统谱系示踪技术存在非特异性标记的缺陷，导致这一问题缺乏体内遗传学证据。
为了阐明AT2细胞能否跨区域参与支气管上皮再生，研究人员首先对传统单同源重组酶示踪工具进行了系统性鉴定。Sftpc-CreER是常用的AT2细胞示踪工具，但分析发现其除了标记AT2细胞外，还“异位”标记了BASCs，而BASCs本身可在肺损伤后贡献club细胞，因此会严重干扰AT2细胞谱系示踪结果。为解决这一问题，研究人员构建了Scgb1a1-DTR-GFP敲入小鼠，通过白喉毒素（DT）特异性清除club细胞和BASCs，同时利用Sftpc-CreER;R26-tdT标记AT2细胞，建立了AT2-tracer1系统（Sftpc-CreER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP）。结合DT诱导的支气管损伤模型，研究人员发现AT2细胞能够迁移进入细支气管，并转分化为club细胞和纤毛细胞，损伤后第4周分析发现约77.42%的支气管末端新生club细胞起源于AT2细胞。AT2细胞主要通过支气管肺泡管连接处（BADJ，路径1）进入细支气管，也可经支气管壁通道（路径2）迁移，其中路径1为主要方式。
进一步，研究人员通过嵌套策略（Nested strategy）构建了AT2-tracer2（Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-NR），其中AT2细胞被特异性标记为ZsGreen，club细胞和BASCs被标记为tdTomato。结合萘（Naphthalene）诱导支气管损伤模型，研究人员发现损伤后第4周约42.93%的支气管末端新生club细胞为ZsG⁺，证实AT2细胞在生理性损伤模型中同样贡献于club细胞再生。随后，研究人员通过交叉标记策略（Intersectional strategy）构建了AT2-tracer3（Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR），可同时三色标记club细胞（tdT⁺ZsG⁻，Club-tracer）、AT2细胞（tdT⁻ZsG⁺，AT2-tracer3）和BASCs（tdT⁺ZsG⁺，BASC-tracer），从而在同一个体中直接比较三者贡献。结果显示，损伤后4周AT2细胞贡献了支气管末端约52.35%的再生club细胞，显著高于BASCs（26.66%）和club细胞自身扩增（14.89%）。长时程（损伤后6个月）追踪并结合单细胞转座酶可及性染色质测序（scATAC-seq）分析显示，AT2来源的club细胞在转录组和表观遗传水平上逐渐与内源club细胞趋同，逐渐失去肺泡特征，获得club细胞功能特征。以上结果表明，支气管损伤后AT2细胞能够跨区域迁移并转分化为club细胞和纤毛细胞，促进末端支气管再生修复。
那么是何种信号通路调控AT2细胞的迁移和转分化？研究人员分选损伤后的AT2-tracer3、BASC-tracer和Club-tracer细胞并进行单细胞转录组测序分析（scRNA-seq）。拟时序分析揭示AT2细胞通过CLDN4⁺中间过渡态分化为club细胞或AT1细胞，呈现双潜能分化轨迹。为验证CLDN4⁺ 中间过渡细胞的功能，研究人员构建了Lamp3-CreER;Scgb1a1-DTR-GFP;Cldn4-LSL-Dre;R26-RSR-LSL-tdT（AT2-tracer4）工具小鼠，可特异性追踪AT2来源的CLDN4⁺ 中间过渡细胞。结合DT损伤模型，发现损伤后4周约62.10%的新生club细胞起源于CLDN4⁺ 中间过渡细胞。进一步在AT2细胞中敲除Cldn4后，发现显著降低AT2细胞向club细胞命运转变。以上结果说明CLDN4⁺中间过渡细胞不仅贡献于细支气管上皮，还功能性促进AT2细胞介导的上皮修复。
功能富集分析显示，中间过渡细胞上调伤口响应、凋亡和迁移相关基因，而club细胞富集异源物质代谢、炎症和Notch信号通路，提示AT2细胞向club细胞转分化可能经历了迁移和转分化两个流程。scRNA-seq分析显示Notch信号通路在AT2细胞来源的club细胞和BASCs来源的中间过渡细胞中上调，提示其可能参与细胞命运转变。为进一步验证，研究人员构建了Scgb1a1-CreER;Sftpc-DreER;R26-TLR;Rbpjrox/rox（实验组）和Rbpjrox/+（对照组）工具小鼠，可在示踪三种细胞的同时在AT2细胞和BASCs中特异性敲除Notch信号通路。结合萘损伤模型，发现敲除组中AT2-tracer3贡献的club细胞比例显著降低，BASC-tracer贡献的club细胞比例也显著降低。进一步，研究人员构建了Sftpc-CreER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;Rbpjflox/flox（实验组）和Rbpjflox/+（对照组）工具小鼠，DT损伤后同样发现敲除Notch信号通路显著抑制AT2细胞向club细胞转分化。而构建Sftpc-CreER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;R26-NICD小鼠激活Notch通路后，发现过表达Notch会显著增强AT2向club细胞转分化。这些功能获得和缺失实验证明Notch信号通路是AT2细胞命运决定的关键调控因子。此外，Rbpj敲除还导致细支气管壁增厚和小气道通气功能下降，表明Notch介导的club细胞再生对结构和功能恢复至关重要。
为进一步寻找Notch信号配体来源，scRNA-seq分析显示损伤后纤毛细胞是主要的Notch配体来源（高表达Jag1/2）。相互作用分析证实纤毛细胞与AT2来源细胞之间存在Jag1/2-Notch1/2信号传导。为功能验证，研究人员构建了Sftpc-DreER;R26-RSR-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;Foxj1-CreER;R26-iDTR（AT2-tracer5）遗传工具，可同时清除club细胞、BASCs和纤毛细胞。结合DT损伤模型，发现清除纤毛细胞后AT2-to-club细胞转分化显著减少。鉴于Jag1-Notch2的强关联性，研究人员分别在纤毛细胞和AT2来源细胞中敲除这一对配体-受体。在Sftpc-DreER;R26-RSR-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;Foxj1-CreER;Jag1flox/flox小鼠中敲除纤毛细胞的Jag1后，AT2来源的club细胞显著减少；在Sftpc-CreER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;Notch2flox/flox小鼠中敲除AT2来源细胞的Notch2后，AT2-to-club转分化同样显著抑制，与Rbpj敲除结果一致。以上结果证明纤毛细胞通过Notch配体JAG1调控AT2-to-club细胞转分化，AT2来源细胞通过Notch2受体接收该信号。
回答了调控细胞命运转变的关键信号通路后，研究人员进一步探究AT2细胞如何响应支气管损伤进行定向迁移。对PBS和DT处理后的Scgb1a1-DTR-GFP小鼠肺脏进行scRNA-seq分析。发现DT损伤显著增强了免疫细胞来源SPP1与AT2细胞表面整合素异二聚体（ITGB1）之间的相互作用。空间转录组分析也显示，与对照组相比，DT损伤后支气管周围免疫细胞浸润增加约3倍，并富集白细胞活化或趋化相关基因。免疫荧光染色进一步证实，DT损伤后大量CD45⁺免疫细胞浸润支气管腔并高表达SPP1，形成密度梯度，提示免疫细胞分泌的SPP1可能介导AT2细胞的定向迁移。为在体内验证，研究人员对AT2-tracer1小鼠DT损伤后进行SPP1抑制剂处理，发现显著抑制tdT⁺细胞向支气管迁移，tdT⁺细胞在细支气管的覆盖率显著降低；在萘诱导损伤的AT2-tracer2小鼠中，SPP1抑制同样减少ZsG⁺细胞在支气管的覆盖率。为进一步验证ITGB1的功能，研究人员构建了AT2特异性Itgb1敲除小鼠（Sftpc-CreER;R26-tdT;Scgb1a1-DTR-GFP;Itgb1flox/flox）。结合DT损伤模型，发现Itgb1敲除显著减少AT2细胞向支气管的迁移，并导致支气管壁增厚和小气道通气功能受损。以上结果证明AT2细胞通过ITGB1接收浸润免疫细胞来源的SPP1趋化信号，引导其向损伤支气管迁移。
综上，该研究通过构建精准的双同源重组介导的谱系示踪技术，系统解析了支气管损伤后上皮再生的细胞来源，首次提供了AT2细胞跨区域转分化驱动支气管再生的体内遗传学证据，揭示了SPP1-ITGB1趋化轴和Notch信号通路在其中的关键调控作用，拓展了对肺再生可塑性的理解，为慢性阻塞性肺疾病、哮喘、支气管扩张等气道损伤相关疾病的治疗策略提供了新的理论依据和潜在靶点。
国科大杭州高等研究院刘扩研究员、分子细胞卓越中心博士后刘子鑫、上海科技大学博士生孟鑫凤、分子细胞卓越中心博士后唐慕雪为该论文共同第一作者。分子细胞卓越中心/国科大杭州高等研究院周斌研究员为该论文通讯作者。国科大杭州高等研究院为该工作的第一完成单位。该工作得到分子细胞卓越中心隋鹏飞研究员和上海交通大学附属胸科医院李锋主任的大力支持。该研究得到分子细胞卓越中心动物实验技术平台和细胞分析技术平台及中国科学院上海营养与健康研究所细胞分析技术平台的大力支持。该研究得到中国科学院、国自然基金委、科技部、浙江省自然基金委、杭高院、新基石科学基金会等支持。
支气管上皮损伤后AT2细胞跨区域参与支气管修复再生
利用双重组酶介导的谱系示踪新技术特异性标记AT2细胞，发现支气管损伤后AT2细胞迁移至细支气管并转分化为club细胞和纤毛细胞，成为远端细支气管上皮修复的主要细胞来源。机制上，损伤后浸润的免疫细胞分泌SPP1，与AT2细胞表面的ITGB1结合，引导AT2细胞定向迁移；AT2细胞到达细支气管后，接收纤毛细胞来源的Notch配体JAG1，通过Notch2驱动其向club细胞转分化。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-11127-w
