4月20日，国际学术期刊eLife在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）周斌研究组与香港中文大学吕爱兰研究组的合作成果，题为“The robust, high-throughput, and temporally regulated roxCre and loxCre reporting systems for genetic modifications in vivo”。该研究开发的roxCre和loxCre两种新型遗传工具，显著提升了体内基因操纵的效率、特异性和精准性，为基因功能研究领域带来新技术。
Cre-loxP技术是体内基因功能研究的重要手段，但存在基因操纵效率与时空可控性难以兼顾的问题。Cre品系虽稳定且高效，但由于其自胚胎阶段便持续基因操纵，不仅存在基因功能改变导致胚胎至死的风险，还制约了科研人员从时空维度深入探究基因功能。CreER品系虽能时空性基因操纵，但loxP横跨序列的长短以及被修饰位点在基因组或染色质中的位置影响Cre-loxP重组的可行性。此外，不同启动子驱动的CreER表达量存在差异，因此CreER小鼠在应对多种等位基因的重组效能存在显著差异。增加Tam给药的剂量虽能提高CreER重组效率，但高剂量的Tam对细胞具有毒害性，从而干扰实验表型，影响研究结果。
为解决上述问题，研究团队设计并构建了roxCre和loxCre系统。roxCre系统基于Dre-Cre双重组酶体系，将rox-Stop-rox序列组件插入Cre序列内，致使Cre蛋白被分为Cre-N端和Cre-C端。仅在Tam(他莫昔芬)诱导下，该系统经由Dre-rox重组反应，能在特异细胞亚群中持续稳定地表达修饰后的Cre(即modified Cre, mCre)。实验验证，mCre在重组效率方面与传统Cre酶效率相当，这一特性使得roxCre系统为精确研究特定细胞亚群中的基因功能提供了强有力的技术支持。
loxCre系统则是在roxCre相同位点插入loxP-Stop-loxP序列组件。在Tam诱导下，loxCre系统显著提升CreER的重组效率。研究数据表明，CreER品系在与loxCre品系协同作用时，对于难重组小鼠品系如Confetti的重组效率从原有的12.21%显著提升至98.32%。在针对难重组的功能基因（如Ctnnb1）的敲除实验中，loxCre系统仅需一剂Tam诱导，即可实现完全基因敲除，而传统CreER在五针高剂量Tam诱导下难以达成。相较于2019年Rui等人发表的iSuRe-Cre系统，loxCre系统具有无明显背景泄漏且系统的启动灵敏性高以及重组效率高等优势，极大地增强了实验结果的特异性和可靠性。该系统能助力CreER系诱导完整的Cre表达，进而实现条件基因靶向操作，提高了CreER小鼠系资源的利用率，为深入开展基因功能研究提供了更为有效的工具。
综上，该研究发表的roxCre和loxCre系统凭借高效重组功能，为精准基因功能的马赛克分析提供了新的技术路径。系统自带的tdT报告基因能够精准指示基因修饰后的细胞命运，使科研人员在细胞水平进行可视化且可靠的基因修饰研究，对深入探索细胞命运决定机制、组织稳态与疾病进展机制的分子机制具有重要推动作用。
分子细胞卓越中心博士生石梦杨和李洁为该论文的共同第一作者。分子细胞卓越中心周斌研究员和香港中文大学吕爱兰教授为该论文共同通讯作者。该研究得到上海南方模式生物科技股份有限公司、泰尔图生物技术有限公司、分子细胞卓越中心动物实验技术平台、细胞分析技术平台、分子生物学技术平台等的大力支持。该工作得到中国科学院、基金委、科技部、上海市科委、香港研资局、新基石科学基金会等支持。
文章链接：https://elifesciences.org/articles/97717
roxCre以及loxCre的工作原理以及基因敲除验证结果示意图
