11月5日，国际学术期刊Nature Methods在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组的最新成果："abcFISH enables multiplexed, single-molecule visualization of circular RNA spatial heterogeneity"。该研究建立了环形RNA单分子原位成像技术abcFISH，解决了环形RNA难以在细胞和组织中原位、定量成像的技术难题，为环形RNA功能解析和病理检测提供了新工具。
除反向剪接位点（BSJ）外，环形RNA在序列上与其同源的线形RNA在一级序列上完全一致，因此难以实现其特异、灵敏的单分子成像。现有成像方法仍受目标长度、检测成本及多色成像能力限制：circFISH要求目标分子足够长以容纳数十条探针，商品化BaseScope则成本高，信噪比不理想，且不支持多色荧光成像等。这些局限制约了对环形RNA空间分布及相互关系的研究，亟需建立灵敏、适用范围广且便于推广的多重成像方法。
abcFISH采用滚环扩增技术（RCA）特异检测环形RNA的BSJ，通过设计分别靶向环形RNA反向剪接位点（BSJ）上下游的padlock探针与primer探针，仅在两探针相邻结合于BSJ位点时触发连接与扩增，从而实现对环形RNA的高灵敏度、高信噪比检测。由于信号产生严格依赖BSJ序列，该方法有效规避了与线性亲本转录本的交叉杂交，且无需依赖长序列容纳大量探针，突破了传统单分子荧光原位杂交（smFISH）对环形RNA长度与丰度的限制。该方法支持多重检测，适用于细胞、小鼠组织及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，拓展了环形RNA成像的应用场景，也为利用存档病理样本开展研究提供了条件。借助abcFISH，研究人员区分了同一基因位点产生的不同环形RNA异构体，实现了多种环形RNA的原位定量检测，并揭示其在不同组织、细胞类型及亚细胞区域中的分布差异，例如circPOLR2A(9,10)在敲入小鼠模型中的组织异质性表达，以及Cdr1as与circAnks1b在海马神经元中的亚区与亚细胞定位差异。
此外，该方法为直接研究环形RNA的在体功能和应用提供了有力工具。例如，在小鼠海马神经元中，应用abcFISH证明了环形Cdr1as与lncRNA Cyrano在单个神经元中丰度显著正相关，支持Cyrano介导Cdr1as稳定性维持的调控模型。在5×FAD阿尔茨海默病模型小鼠中，利用abcFISH检测到表达治疗性环形RNA的细胞，其周围星形胶质细胞浸润显著降低，展示了该方法将RNA空间分布与局部病理变化相联系、辅助评估环形RNA干预效果的潜力。总之，abcFISH为环形RNA研究提供了兼具单分子分辨率和空间信息的分析工具，有望推动其功能解析、疾病标志物探索及环形RNA药物评价。
分子细胞卓越中心陈玲玲研究员为该论文的通讯作者。分子细胞卓越中心刘昱昕博士、姜博文博士为该论文的共同第一作者。复旦大学生物医学研究院杨力教授和博士生刘铠铭对该项工作给予了大力支持。该项研究工作得到分子细胞卓越中心细胞分析技术平台、动物实验技术平台、分子生物学技术平台等的大力支持。
文章链接：https://www.nature.com/articles/s41592-026-03299-0
abcFISH方法与应用示意图
